161695. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-) cisz-1,2-epocipropilfoszfonsav előállítására

161695 6 mikroorganizmus alkalmazása során a fermentációt körülbelül 20—40 °C hőmérsékleten folytathatjuk le. Optimális eredmények elérésére azonban egyszerűbb a fermentáció 26-30 °C közötti lefolytatása. A mikroorganizmus tenyésztésére és antibiotikum-termelésre alkalmazott táptalaj — pH körülbelül 5,0—9,0 között váltakozhat. A kitüntetett pH-tartomány azonban körülbelül 6,0—7,5. A fermentációs eljárás keretében sejtszuszpenziót állítunk elő oly módon, hogy steril közeget adunk hozzá egy (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav-termelő mikroorganizmus ferde agar tenyészetéhez. A ferde tenyészetről kapott fázist használjuk ezután inokulumlombik beoltására, és az inokulumlombikot körülbelül 28 °C-on 1—3 napig rázatjuk jó növekedés elérésére. Az inokulumlombikot ezután a termelő lombik beoltására használjuk fel. Egy másik megoldás szerint az inokulumlombikot liofilizált tenyészettel vagy fagyasztott inokulummal olthatjuk be. Az inokulálást általában úgy hajtjuk végre, hogy 1 ml-t veszünk a termelő táptalaj 30 miének beoltásához, amely a kívánt koncentrációjú citrátot tartalmazza, és a fermentációt 2—4 napon át folytatjuk a táptalaj kevertetése és/vagy levegőztetése mellett, a hőmérsékletet körülbelül 28 °C-on tartva. Ezután, általában 3—4 nap múlva megvizsgáltuk mindegyik termelő lombikot — azokat, amelyek beadagolt citrátot tartalmaznak és a kontrollként használt lombikokat is — az egyes lombikokban keletkezett antibiotikum mennyiségének meghatározására. A (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsavat célszerűen úgy határozzuk meg, hogy korong-lemezes módszert alkalmazunk tesztorganizmusként Proteus vulgaris MB 838 (ATCC 21 100 és NRRL B—3361) felhasználásával. A vizsgálati tenyészetet 0,2% élesztőkivonatot (Difco) tartalmazó (Difco) tápagaron, ferde kultúrában tartjuk fenn. A beoltott kémcsöveket 18—24 órán át 37 °C-on inkubáljuk és felhasználásig hidegszoba-hőmérsékleten tároljuk. Hetenként készítünk friss kémcsőtenyészeteket. A próbalemezek inokulumát naponként állítjuk elő oly módon, hogy egy ferde agart lekaparunk és ezzel egy 50 ml (Difco) húslevest — 0,2% Difco élesztőkivonattal együtt — tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer-lombikot oltunk be. A lombikot 37 °C-on 18—24 órán át rázógépen inkubáljuk. A fermentlevet ezután 660 ny* hullámhosszon 0,2%-os élesztőkivonat-oldatnak a tenyészethez való hozzáadásával Bausch & Lomb Spectronic 20 felhasználásával 40%-os áteresztésre állítjuk be. Ehhez a meghatározáshoz vakpróbaként be nem oltott levest használtunk. A beállított tenyészetből 30 ml-t vettünk 1 1 táptalaj beoltásához. Próbatáptalaj ként 0,2% élesztőkivonatot (Difco) tartalmazó Difco tápagart használtunk. Ezt a táptalajt elkészítettük, autoklávban sterileztük és 50 °C-ra engedtük hűlni. A táptalaj beoltása után 10 ml-t mértünk steril Petri-csészékbe és a közeget megszilárdulni engedtük. Az aktivitást egységekben fejezzük ki. 1 egység az a milliliterenkénti antibiotikum-koncent-5 ráció, amely 12,5 mm méretű papírkorongon 28 mm zónaátmérőt hoz létre. 4 antibiotikum-koncentrációt alkalmazunk a standard görbe felvételére (0,3; 0,4; 0,6 és 0,8 egység/ml). Az egyes koncentrációkat pH 8,0-ra beállított 0,05 M trisz-10 -hidroximetil-aminometán pufferrel való hígítással kaptuk. Az öt lemez mindegyikén 4—4 korongot helyeztünk el a standard görbe felvételére. Minden lemez a fent megadott négy antibiotikum-koncentráció mindegyikéből 1—1 ko-15 rongot tartalmazott. A lemezeket 18 órán át 37 °C-on inkubáljuk és lemérjük — milliméterben — a gátlási zónák átmérőjét. Minden koncentrációra kiszámítjuk az átlagos zónaátmér Őt; ebből féllogaritmikus diagrampapíron felvesszük a 20 standard görbét. A kapott egyenes iránytangense 4 és 5 közötti. A termelő lombikokat ezután úgy határozzuk meg, hogy a mintát pH 8 0,05 M pufferben megfelelő koncentrációra hígítjuk. A tesztorganizmus 25 Proteus vulgaris MB—838, és a vizsgálati táptalaj 0,2% élesztőkivonatot tartalmazó tápagar. Ha a korong-lemezes vagy gyűrűs-lemezes vizsgálati módszert alkalmazzuk, legalább 10—15 ml táptalajt öntünk egy-egy csészébe. Ha a koronglemezes eljárást alkalmazzuk, a korongokat 0,4 egység/ml antibiotikum-koncentrációjú oldatokba merítjük és a mintával szemben helyezzük el a lemezen. A lemezeket ezután 37 °C-on 18 órán át inkubáljuk és meghatározzuk — milliméterben — a zónaátmérőket. Ha a gyűrűs-lemezes eljárást alkalmazzuk, 6 gyűrűt — hármat a minta és hármat a kontrolloldat számára — használunk lemezenként, és váltakozva mérjük be a minta-és a kontrolloldatot. A kontrolloldat 1 gamma/ml szabad savat tartalmaz, öt standard lemezt veszünk, amelyek 6 standard koncentrációt tartalmaznak a 0,25 gamma/ml — 3,0 gamma/ml tartományban. A számszerű kiértékelést Nomograph-43 fal végezzük és az eredményeket gamma/ml-ben vagy egységekben adjuk meg. A szabad savból 1 egység 2,8 gammának felel meg. Az antibiotikum számos eljárással tisztítható és tisztább alakban kinyerhető. Egyik ilyen eljá-5Q

rás abból áll, hogy az antibiotikumot alumíniumoxidon adszorbeáltatjuk; mind bázissal, mind savval mosott alumíniumoxid alkalmazható ehhez a tisztításhoz. Az adszorbeált antibiotikum legegyszerűbben körülbelül pH 11,2 vizes vagy 55 vizes-alkoholos ammóniumhidroxid-oldatokkal eluálható; az eluátumot frakcionáltan fogjuk fel. A (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav ammóniumsóját tartalmazó szennyezett szilárd frakciók tisztítása úgy is végezhető, hogy az anyagot me-60 tanolban oldjuk, azonos térfogatú n-butanolt adagolunk, a metanolt ledesztilláljuk, és kiszűrjük a butanolban oldhatatlan anyagot. Így a megnövelt tisztaságú antibiotikum ammónium-65 sóját tartalmazó butanolos oldatot kapunk. Az 35 40