161695. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-) cisz-1,2-epocipropilfoszfonsav előállítására

161695 őrzött körülmények között más Streptomycestörzseket tenyésztünk, amelyeket ugyancsak talajból izoláltunk és amelyeket a Merck & Co., Inc. kultúrgyűjteményében MA—2867, MA—2903 MA—2916, MA—2917, MA—3270, MA—3272 és MA—3267 tenyészetként azonosítottunk. Ezeket a tenyészeteket a Streptomyces viridochromogenes species tagjaiként osztályoztuk. Az MA—2903, MA—2867, MA—2917 és MA—3270 tenyészetet az US Department of Agriculture Northern Utilization Research and Development Division-ja tenyészetgyűjteményében helyeztük el állandó megőrzésre, és ezeket az NRRL—3413, NRRL—3414, NRRL—3415, NRRL—3416 és NRRL—3427 számmal látták el. Az MA—3269 tenyészetet a Streptomyces wedmorensis specieshez soroltuk és az NRRL—3426 számmal láttuk el. A fenti mikroorganizmus-specieseken kívül más mikroorganizmusok felhasználását is vizsgáltuk; ezek Streptomyces-törzsek, amelyeket vagy a természetből izoláltunk, vagy ezen organizmusok mutációjával állítottunk elő. A mutánsokat természetes szelekcióval vagy mutagen ágensekkel, például X-sugárral való besugárzással, UV-besugárzással, nitrogénmustárral stb. való kezeléssel kaptuk. Mivel a fermentleben jelenlevő nagy mennyiségű szennyezés miatt igen bonyolult a tiszta (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav izolálása, nagy jelentőségű, hogy módot találjunk az antibiotikum koncentrációjának a fermentlé összes szilárdanyag-tartalmához képest való növelésére. Azt találtuk, hogy citrát hozzáadása a komplex szerves és kémiailag definiált fermentléhez növeli a (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav-termelést. „Komplex szerves táptalajon" olyan közegeket értünk, amelyben a komponensek kémiailag nem definiáltak. Példa az ilyen táptalajra az, amely őrölt zabot, szójalisztet, nátriumaszkorbátot és desztillációs maradékot tartalmaz. A „kémiailag definiált közeg" olyan táptalajt jelent, amelyben valamennyi komponens kémiailag definiált. Példa az ilyen táptalajra az, amely kukoricakeményítőt, káliumhidrogénfoszfátot, nátriumaszkorbátot, aszparagint, metionint, mononátriumglutamátot, kalciumkloridot, magnéziumszulfátot és vas(II)-szulfátot tartalmaz. Az antibiotikum termelésének fokozásához szükséges citrátmennyiség az alkalmazott közegtől függ. Az egy adott táptalaj-összetétel esetében alkalmazott tényleges citrátkoncentráció a használt konkrét mikroorganizmustól és az alkalmazott fermentációs körülményektől függően változik. Fokozott antibiotikum-termelést figyeltünk meg olyan táptalajokon, amelyek körülbelül 4—8 g/l nátriumcitrát alakjában adagolt citrátforrást tartalmaznak. Általában azt találtuk, hogy kb. 0,50 — kb. 8,0 g/l citrátforrás hozzáadása növeli az antibiotikum-termelést. Nátriumcitrát hozzáadása egy komplex szerves tápanyagokat tartalmazó közeghez például 95%-kal növeli a (-) cisz-1,2-epoxipropilfoszfonsav-termelést, ha a nát-20 25 riumcitrát a kb. 1,0 g/l — kb. 8,0 g/l koncentrációtartományban van jelen. Ezzel összhangban kémiailag definiált vagy szintetikus táptalajon citrátforrás hozzáadása kimutathatóan 6—7-sze-5 résre növelte a (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav termelését például akkor, ha a nátriumcitrát koncentrációját a táptalajban 1-ről körülbelül 4 4 g/l-re növeltük. Így kb. 0,65 — kb. 5,2 g/l táptalaj értékkel egyenértékű citrátkoncentráció fo-1* kozza az antibiotikum-termelést. Bármely citrátforrás alkalmazható, amely megfelelő citrátkoncentrációt biztosít a fermentleben. A citrátot előnyösen szervetlen só formájában (például kálium-, nátrium- vagy kalciumcitrát) 15 adagoljuk, bár alkalmazható a szabad sav is. A citrát bevihető természetes alakban vagy komplex alakjában is, amely citromsavban gazdag mikrobiális tápanyagokban lehet jelen. A szokásos táptalaj komponensek: asszimilálható szénforrás, asszimilálható nitrogénforrás, szervetlen sók és szükség esetén növekedési faktorok. Vizsgáltuk a citrát hozzáadását más, (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav termelésére képes mikroorganizmusokat tartalmazó fermentlevekhez. A citrátforrást alkalmazhatjuk más, a (-) cisz-1,2--epoxipropilfoszfonsav termelését elősegítő anyagokkal, például kobalttal, mononátriumglutamáttal, foszforforrással, metioninnel és L-ciszteinnel 30 együtt is. Az egyéb termelésfokozók jelen lehetnek a fermentleben mint táptalajok, vagy adalékanyagként szerepelhetnek. Citrát más stimulátorokkal együtt való alkalmazása az antibiotikum termelésére az antibiotikum-szint további 35 növekedését eredményezi. Bár a találmány szerinti új antibiotikum felületi és süllyesztett tenyészetben egyaránt előállítható, újabban előtérbe került a fermentáció süllyesztett fázisban való végrehajtása. Kis volu-40 menü fermentációkat célszerűen úgy hajthatunk végre, hogy megfelelő mennyiségű táptalajt lombikokba helyezünk, a lombikokat és tartalmukat 120 °C-ra való melegítéssel sterilizáljuk, a lombikokat beoltjuk valamely (-) cisz-l,2-epoxipro-45 pilfoszfonsav-termelő mikroorganizmus, például egy Streptomyces-törzs spóráival vagy vegetatív sejttenyészetével, lazán bedugjuk a lombikok nyakát vattával, és állandó, körülbelül 28 °C hőmérsékletű helyiségben 3—5 napon át folytatjuk 50 a fermentációt. Nagyobb volumenű munka esetén a fermentációt célszerűen megfelelő, keverővel és a fermentlé levegőztetésére szolgáló berendezésekkel ellátott tankokban végezzük. E módszer szerint a táptalajt a tankban állítjuk össze 55 és 120 °C-on hevítéssel sterilezzük. Lehűlés után a steril táptalajt beoltjuk a mikroorganizmus vegetatív sejttenyészetével és 2—4 napon át folytatjuk a fermentációt a táptalaj kevertetése és/vagy levegőztetése mellett, a hőmérsékletet körülbelül 28 °C-on tartva. Ez az eljárás a (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav előállítására különösen alkalmas nagy mennyiségű új antibiotikum termelésére. 65 A (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav-termelő 60