161653. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkalokus proteáz mikrobiológiai előállítására

3 161653 4 nek és hatásának bemutatására a gyakorlati alkalmazásban. Az általunk talált, Bacillus licheniformisból származó proteáz a 10—10,5 pH-értékig terjedő, erősen alkalikus tartományon belüli optimális pH-értéknél fejti ki aktivitását, akár kazeint, akár hemoglobint vagy albumint használunk szubsztrátumként, ezért nyilvánvaló, hogy ez a proteáz alkalikus proteáz. Ily módon a találmány új alkalikus proteázt szolgáltat, mely egy Bacillus licheniformishoz tartozó törzs tenyésztésével állítható elő. Az új alkalikus proteáz iparilag széles körben használható, így az élelmiszerek gyártása, a nyersbőrfeldolgozásban, a textilipar, a mosodaipar területén stb. A fentiekhez hasonló előnyös tulajdonságokat mutató proteáz enzim előállítását az eddigi irodalom nem ismerteti. A Journal of Biological Chemistry, 239, 538—543 (1964) olyan proteáz enzimnek a Bacillus licheniformis kultúráiból történő előállítását ismerteti, amely enzim ugyan igen széles pH-tartományban hatásos a szerző szerint (6,0 és 10,7 van két határértékként megadva), de — amint az 542. oldal 2. hasábján olvasható — nincs meghatározott optimumcsúcsértéke, hanem annál a pH-értéknél, amelynél a bejelentésünk szerinti, egyébként még jóval szélesebb alkalikus pH-tartományban aktív proteáz optimumcsúcsértéket mutat, akitivitását már teljesen elveszti; tehát semmi aktivitása nincs a 10,6—12 pH-tartományban, ahol a találmány szerint előállított enzimkészítmény még igen jó hatású. Hasonlóképpen nem termelnek alkálitűrő, valamint kelátképző és redukálószerekkel szemben is aktivitásukat megtartó proteáz enzimeket a fentebb idézett egyéb közleményekben ismertetett mikroorganizmusok sem. A találmány értelmében az alkalikus proteázt a feltalálók által talált és azonosított Bacillus licheniformis törzseknek a szokásos folyékony táptalajokon levegőztetéssel történő tenyésztése, majd a kapott nyers proteáznak ismert módszerekkel való tisztítása útján állítjuk elő. Az alkalikus proteázt termelő új B. licheniformis törzset a japán „Fermentation Research Institute Agency of Inductrial and Technology" intézetnél FERM-P-No. 387 sz. alatt, az amerikai „Americal Type Culture Collection" intézetnél pedig ATCC 21471 sz. alatt letétbe helyeztük. A jelen találmány feltalálói által elkülönített új Bacillus licheniformis törzs az alábbi jellemző morfológiai és biológiai tulajdonságokat mutatja: Pálcika alakú vegetatív sejtek: 0,6—0,8x1,5—3,0 mikron méretűek, láncokat, kapszulákat vagy árnyékalakokat nem képeznek. Mozgékonyak, gram-pozitívak. Glükózos agar tápközegen a pálcika alakú sejtek ugyanolyanok, mint közönséges agar tápközegen; néhány zsíros gömböcskét tartalmaznak; olykor nagyobb méretű sejtek figyelhetők meg. Sporangiumok: nincsenek határozottan megduzzadva, gyakran bipolárosan színezett pálcikákra hasonlítanak. Spórák: 0,6—0,9x1,0—1,5 mikron méretűek, ovális vagy hengeres, centrális vagy paracentrális alakúak, vékony falúak; 37 °C hőmérsékleten 48 óra alatt nagy számban képződnek. Agar tápközegen: a telepek durva felületűek, szőrös kinövésekkel, szétterülőek. 5 Ferde agar tápközegen: bőséges fejlődés, durva felületű átlátszatlan, szétterülő telepek; a felület fénytelen, szőrös kinövésekkel. Folyékony tápközegen: tiszta folyadék, erősen ráncos, szívós felületi hártyával. 10 Szúrt kultúra zselatinon: kráterszerűen vagy rétegesen terjedő gyors elfolyósodás. Nátriumkloridos folyékony tápközeg: 5—8% NaCl: jó fejlődés; 12% NaCl: fejlődés nincs. Glükózos ferde agar táptalajon: erős fejlődés, 15 ráncos telep, kinyomuló cseppekkel, nyálkás. Tirozinos ferde agáron: ugyanolyan, mint közönséges agar táptalajon. Citráthasznosítás: pozitív. Burgonyaszeleten: erős fejlődés, szétterülő, ráncos telepek, szemölcsszerűén kinyomuló cseppecskékkel; rózsaszínű, a burgonya alámerülő részén vörös vagy barna. Szójás ferde agáron: lágyabb és bőségesebben fejlődő, mint közönséges agar táptalajon; barnás vagy vöröses, kinyomuló cseppecskékkel. Glükózos-nitrátos ferde agáron: lassú fejlődés, szőrös kinövésekkel, később mérsékelt vagy bőséges fejlődés. Keményítőhidrolízis: pozitív. Acetilmetilkarbinol-termelés: pozitív (32 °C-on). Glükózos folyékony tápközeg pH-értéke: 7 nap után 5,6. Fermentációs próbák: arabinóz, xilóz, glükóz, szacharóz és mannit esetén savas közeg, gázfejlődés nélkül (14 nap alatt). Kazeinhidrolízis: pozitív, keskeny kitisztulási zónával. 40 Zselatinhidrolízis: pozitív, széles hidrolíziszónával. Nitrátredukció nitritté: pozitív. Anaerob gázfejlesztés nitrátból: pozitív. Anaerob fejlődés folyékony glükóz tápközegen: 45 pozitív, pH = 5,2 a 14. napon, igen csekély mennyiségű gáz fejlődik. A fejlődésre kedvező hőmérséklet: 32—45 °C-on jó fejlődés. A fenti új, alkalikus proteázt termelő törzs gyakorlati célú tenyésztésére szolgáló tápközeg-50 ben szénforrásként célszerűen glükóz vagy keményítő, nitrogénforrásként pepton vagy kazein alkalmazható: felhasználhatók erre a célra továbbá természetes tápanyagok, mint élesztőkivonat vagy húskivonat; a tápközegben ezeken kí-55 vül szervetlen sókat is alkalmazunk. Természetes tápközegként felhasználható továbbá a zsírtalanított szójapogácsa kivonata, valamint rizskorpa és gabonakorpa is. A mikroorganizmust a maximális proteázak-60 tivitás elérése érdekében 30—35 °C hőmérsékleten, levegőztetéssel, kb. 7,0 pH-értékű közegben, 40—72 óra hosszat tenyésztjük. 35 °C hőmérsékleten történő tenyésztés esetén a fermentlé proteázaktivitása 40 órán belül eléri a maximális 65 értéket.