161653. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkalokus proteáz mikrobiológiai előállítására
161653 5 A fermentációs közegben felgyülemlett alkalikus proteázt oly módon nyerjük ki, hogy a fermentációs termékből először eltávolítjuk a baktériumtesteket, majd a levet betöményítjük és a hatóanyagot kisózás, dialízis, derítés, ioncserélő * cellulóz- vagy Sephadex-oszlopon való kromatografálás és gélszűrés útján tisztítjuk és izoláljuk. E műveleteket, egyes paramétereit, valamint az elérhető proteázaktivitásnak az eljárási körülményektől való függését a csatolt rajzok gr a- 10 fikus ábrázolásban szemléltetik. Az 1. ábra a tisztítás céljából baktériummentesítésnek, kisózásnak, dialízisnek és színtelenítésnek alávetett tápoldat, és a karboximetilcellulóz oszlopon kro-I matografált, tisztított alkalikus proteáz kroma- 15 L togramját mutatja be. Az 1. ábra 1 görbéje a • protein koncentrációját, 2 görbéje a proteáz ak• tivitását, a 3 egyenes a nátriumklorid koncent* rációját jelzi. Az 1. ábrából látható, hogy a proteáz aktivitása a (C) csúcsfrakcióban koncentrálódik és a (D) frakcióban is megfigyelhető egy kis mennyiségű proteázaktivitás. A (C) frakcióban koncentrálódott proteáz az általunk talált Bacillus licheniformisból származó alkalikus pro-25 teáz, és nem találtunk más olyan frakciót, mely az 1. ábrán látható proteázaktivitást adta volna. E tények azt mutatják, hogy a nyers proteáz 1, tisztítása könnyen elvégezhető, és a találmány •t szerinti eljárással igen előnyös módon állíthatjuk elő a nagy tisztaságú és kedvező tulajdonságokat mutató alkalikus proteázt. A találmány szerint előállított alkalikus pro? teáz jellemzőit a 2—5. ábrák szemléltetik. A 2. - f ábra az alkalikus proteáz és a pH-érték közötti összefüggést mutatja be. A 2. ábrán látható, hogy az optimális pH-érték a 10—10,5 tartományban van abban az esetben, ha szubsztrátumként kazeint használunk, és ez az optimális pH-érték akkor sem változik meg, ha hemoglobint vagy .» albumint használunk szubsztrátumként. A 3. ábra az alkalikus proteáz és a hőmérséklet közötti összefüggést mutatja be. Az 1 görbe a pro^ teáz aktivitását jelzi abban az esetben, ha a \ • szubsztrátum 5x10-13 mól kalciumacetátot tar- .. talmaz. A 3. ábrán látható, hogy az optimális tenyésztési hőmérséklet 60 °C és, hogy a proteáz 80 °C-on inaktiválódik. A proteáz aktivitása jelentősen megnő abban az esetben, ha a reakció; , keverék kalciumacetátot tartalmaz, miként azt 50 • az 1 görbe mutatja, ugyanakkor azonban az optimális tenyésztési hőmérséklet nem változik lényegesen. Egyébként az alkalikus proteáz aktivitását a Hagihara által a „Method for the Investigation 55 ?- of Enzymes" című könyv (kiadó: Asahura könyvkereskedés) 2. kötetének 240. oldalán leírt módszer szerint vizsgáltuk. A proteázt kazeint tartalmazó 10 pH-értékű oldattal 30 °C-on összekefifl ;, vertük; a kazein tirozinná hidrolizálódott és a nem hidrolizált kazeint B kicsapószerrel, mely 0,11 mól CCI3COOH, 0,22 mól CH3 COONa és 0,33 mól CH3COOH keveréke, kicsaptuk, majd a szűr-I let fényabszorpcióját 257 mí«-nél mértük. A pro- 65 6 teáz aktivitását az „egység", azaz az egy perc alatt képződő tirozin mennyisége (y) jelzi. A 4. ábra az alkalikus proteáz hőstabilitását mutatja be. A 4. ábra 1 görbéje jelzi, hogy a proteáz 55 °C-ig állandó abban az esetben, ha a reakciókeverék 5X10-3 mól kalciumacetátot tartalmaz és 15 percig használjuk 10 pH-értéken. A 2 görbe azt jelzi, hogy a proteáz aktivitása rohamosan csökken abban az esetben, ha a tápközeg nem tartalmaz kalciumacetátot és az 1 görbével azonos körülmények között használjuk. Az 5. ábra az alkalikus proteáz aktivitása és a pH-érték közötti összefüggést mutatja be, ha a reakciókeveréket 22 órán át 30 °C-on tartjuk. Az 1 görbe a proteáz aktivitását jelzi abban az esetben, ha a reakciókeverék 5x10-3 mól kalciumacetátot tartalmaz, a 2 görbe ugyancsak a proteáz aktivitását jelzi abban az esetben, ha a reakciókeverék nem tartalmaz kalciumacetátot. Az 1 és 2 görbékből nyilvánvaló, hogy a proteáz 5,0—11,0 pH-tartományban állandó. A találmány szerinti alkalikus proteáz aktivitását nehézfémionok, mint Hg- és Cu-ionok, de különösen oxidálószerek, mint pl. jód, vagy diizopropilfluorfoszfát (DFP) és burgonyainhibitor gátolják, redukálószerek, mint pl. cisztein, kelátképző anyagok, mint pl. E.D.T.A., monojódecetsav és SH-reagens azonban nem gátolják. A találmány szerint előállított alkalikus proteáz számított molekulasúlya 21 800; elemi analízis során talált összetétele: N 14,33%, C 45,75%, H 7,06%, S 0,45%. A molekulasúlyt az eluálási térfogat alapján számítottuk ki; 2.10-3 mól kalciumacetátot tartalmazó, 7,0 pH-értékű trisz-malát-pufferrel készített 10-2 mólos oldatot egy 20x1026 mm méretű Sephadex G-75 oszlopon vezettünk át és 50 ml/óra sebességgel eluáltunk. Az enzim nehezen kristályosítható, ezért azonosítási adatként a papír-elektroforézis során mutatott mobilitását mértük. Az elektroforézist 5. sz. Toyo-szűrőpapíron végeztük, 4x15 cm méretű lapokkal, 0,05 mól trisz-puffert (2-amino-2-hidroximetil-l,3-propándiol) és sósavat tartalmazó, 8,5 pH-értékű oldattal, 450 V feszültséggel, 10 °C hőmérsékleten, 8 óra hosszat. Az ilyen körülmények között meghatározott mobilitás: 6,6.10-6 cm 2 /mp/V. A találmányt a következő példák szemléltetik: 1. példa Bacillus licheniformist 1% glükózt, 1% peptont, 0,1% élesztőkivonatot, 0,26% nátriumkloridot, 0,2% kalciumkloridot, 0,05% káliumfoszfátot, 0,01% magnéziumszulfátot és 0,001% ferroszulfátot, valamint 0,001% mangánszulfátot tartalmazó 7 pH-értékű 1 liter tápoldatban inkubáltunk. A Bacillus licheniformist rázás közben 30 °C-on, 72 órán át tenyésztettük. Az így kapott tápoldat tartalmazta az alkalikus proteázt, melynek aktivitása 1,930 egység/milliliter volt. A tápoldatot baktériummentesítettük, centrifugát vagy szűrőt alkalmazva, majd a szűrletet 0,8 telítesű 4
