161567. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimek és enzim-inhibitorok dúsítására

5 161567 6 3. példa. Vízokihatatlan inhibitor (Trasylol®)-flyanták előállítása. Anion os (A) gyanta: 23 ml 0,2 mól pH 8,0 foszfát-puff er és 2,0 ml 0,1%-os hexametiléndiamin-oldat (HMD) elegyéhez 120 mg EMA-81 illetve EMA-31 gyantát (MONSANTO) adtunk. A keveréket rövid ideig homogenizáltuk, kevertük, és pontosan 5 perccel (az EMA-31 gyanta esetében 3 perccel) a gyanta hozzáadása után 200 mg (tripszinre vonatkoztatva körülbelül 600000 ImU) tripszin- kallikrein-inhibitor 30 ml ugyanezen foszfát-pufferrel előállított oldatát adtuk hozzá. A reakció keveréket éjjel (16 órán át) jégszekrénybe kevertük, majd centrifugáltuk és meghatároztuk a felülúszóban a meg nem kötött inhibitor mennyiségét. Az inhibitor-gyanta-10 üledéket 0,2 mól pH 7,8 trietanolamin-pufferrel többször "mostuk, míg a mosóvíz inhibitor-mentessé vált. Mindenműveletet 0 - 4C°-ra való hűtés mellett végeztünk. Semleges (N) gyanta: a reakcióelegy összeállítása az A-gyantánál ismertetettel azonos. Pontosan 8 perccel azután, miután az inhibitor-oldatot hozzáadtuk a gyanta-szuszpenzióhoz (EMA-81), meg 1,6 g N-dimetiletiléndiamin (NND) kevés vízzel (1:1 térfogatarány) előállított, 2 n HQ-val pH-8-ra beállított oldatát adtuk a reakcióelegyhez (gyanta * inhibitor). Az így kapott keveréket még 2 órán átkevertük, majd centrifugáltuk és az oldhatatlan inhibitor-gyantát a fent megadott módon tovább kezeltük. A táblázatba beiktatunk egy olyan N» gyantát is, amelynél az N.N-dimetiletiléndiaminhidrokloridot 8 perc helyett már 5 perc múlva adtuk hozzá a reakcióelegyhez (gyanta • inhibitor). Alkalmazott gyanta-típus Keverési idő a HMD NND hozzáadása után A gyantán megkötött inhibitor-mennyiség % Inhibitorgyantajelölés hozzáadása után EMA-31 EMA-81 EMA-81 92 81 32 A-gyanta N, —gyanta N5

—gyanta a) Tripszin és kimotripszin adszorpciója és disszociációja anionos (A) és semleges (N) inhibitor-gyantán. 30 Adszorpció: Az inhibitor-gyantát körülbelül 20 ml 0,1 mól pH 7,8 trietanolamin-pufferben (amely NaCl-ra 0,1 mólos és CaClj-ra 0,01 mólos) elkeverjük és hozzáadjuk a kevés pufferben oldott fölös mennyiségű enzimet 2 órai (esetleg még 1 éjszakán át tartó) keverés után centrifugáljuk és 35 meghatározzuk a felülúszóban maradt enzim mennyiségét. Az oldhatatlan gyanta-komplexet pH 7,8 pufferrel mossuk, míg a mosóvízben mát nem mérhető enzimaktivitás. Munkahőmérséklet 0-4 C °. Disszociáció és elúció: Az utolsó mosás után az oldhatatlan enzim-inhibitor-gyanta komplexet körülbelül 50 ml 0,3 mól KQ- oldatban szuszpendáljuk és 2 n HCl hozzáadásával beállítjuk a szuszpenzió kívánt pH-értékét. Két órai keverés után a savas szuszpenziót ismét centrifugáljuk és meghatározzuk a felülúszó enzimaktivitását. Az enzimnek a gyantáról való tehes leoldására ezt a folyamatot addig (3-4-szer, 50-50 ml-rel) ismételjük, míg a felülúszóban nem mutatható ki említésreméltó mennyiségű enzim. Alkalmazott inhibitorgyanta a gyantán megkötött inhibitor mennyiség típus, tripszinre vonatkoztatott (IU) Adszorbeált enzim-menynyiség mg%a Leoldott enzimmennyiség az adszorbeált %-ában az alábbi pH-n összesen . tripszin 3,5 3,0 2,5 2,0 1,7 A N, 66,8 42,9 11,8 18 18,8b

44 0 1 0 11 1 36 9 60 69 90 kimotripszin A v 66,8 42,9 3,7 3,5 15,7 37 0 31 1 45 6 37 17 17 80 a: arra az enzim-mennyiségre vonatkoztatva, amelyet 00 ugyanilyen mennyiségű inhibitor oldatban gátol b: a gyantaelső alkalmazása esetén 27,3 mg (64%a

); 4-szeri alkalmazása után konstans: 13 mg (30%a

). b. A kallikrein semleges inhibitor-gyanták segítségével végzett dúsítása. 66 Az N5

és N, inhibitor-gyantát alkalmaztuk. Az adszorbeál tatáshoz a kallikreint körülbelül 20 ml 0,1 mól trietanolamin- pufferben (ez NaCl-ra 0,1 mólos) - pH 7-8-oldottuk és az inhibitor-gyantát keverés közben hozzáadtuk a kallikrein-oldathoz. Körülbelül 14 órás kevertetés után 70 (éjszakán át, egyébként 2 óra elegendő) az elegyet centrifugáltuk és meghatároztuk a felülúszóban a meg nem kötött kallikreint Az oldhatatlan kallikrein-inhibitorgyantakomlexet pufferrel kallikrein- és proteinmentesre mostuk. A kallikereinnek az, inhibitorgyanta-komplexról való' leoldását 0,38 - 1 mól guanidinsóoklatokkal vágeztuk, amelyeket 0,1 mól nitriumacetát-pufferrel állítottunk be a kívánt értékre. A kallikrein) teljes leoldásához a gyanta-komplexet 4-5-ször l-l órán át kell kevernünk körülbelül 20 ml guanidinsóoldatban, majd az inhibitor-gyantát centri» fugáljuk (munka-hőmérséklet 0 - 4 C°) 3