161558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív pepsztatin előállítására
161558 19 20 elegyben oldjuk, majd a 4. példában leírt módon s2ilikagélen kromatografáljuk azzal a különbséggel, hogy eluálószerként 3:1 aányú etilacetát-metanol elegyet alkalmazunk. Az eluátumot 5-g-os frakciókban gyűjtjük össze. A pepsztatin a 10—20: frakciókban jelenik meg. Ezeket a frakciókat egyesítjük és bepároljuk. 0,29 g fehér port kapunk, amely 0,03 : «g/ml koncentrációban fejt ki 50%-os pepszingátló hatást.. Metánokra kristályosítás után 0,14 g tűkristályos pepsztatint kapunk, o. p.: 224—226 °C. 6. példa 200 liter térfogatú rozsdamentes acélfermentorba 150 liter, az 1. példában leírt összetételű táptalajt helyezünk, és 115 °C-on 30 percig sterilizáljuk. A táptalajt 1 liter rázott Streptomyces testaceus MC144—Cl törzstenyészettel oltjuk be. (A rázott tenyészetet az 1. példában leírt módon, 72 órás tenyésztéssel állítjuk elő.) A fermentlevet 200 fordulat/perc sebességgel keverjük, és 200 liter/perc mennyiségű steril levegővel levegőztetjük. A tenyésztést 24 °C-ón 72 órán át végezzük. Ekkor az elegy pH-ja 7,42, és 0,05 ml, 250-szeresére hígított szűrt fermentlé 51,5%-os pepszingátló hatást mutat. A tenyészethez 4,5 kg diatomaföldet adunk, szűrjük, és a szűrőlepényt 12 liter desztillált vízzel mossuk. A szűr letet és a mosófolyadékot egyesítjük, a kapott 133 liter folyadékot 3 n nátriumhidroxid-oldattal pH = 8,2 értékre lúgosítjuk, és egymás után 60 liter, majd 30 liter n-butanollal extraháljuk. A butanolos oldatokat egyesítjük, 11 liter, majd 9 liter vízzel mossuk, és csökkentett nyomáson bepároljuk. A csapadékot összegyűjtjük és szárítjuk. 38.4 g barna port kapunk, amely 0,10 i"g/ml koncentrációban fejt ki 50%-os pepszingátló hatást. A felső folyadékréteget szárazra, pároljuk. További 13,0 g barna, nyers port kapunk, amely 0,17 i"g/ml koncentrációban fejt ki 50%-os pepszingátló hatást. A port 70%-os hozammal távolítottuk el a szűrt fermentléből. 7. példa 6000 literes fermentorba 3000 liter, az 1. példában ismertetett összetételű táptalajt öntünk, és a táptalajt sterilizáljuk. A steril táptalajt a 3. példában leírt módon, 200 literes fermentorban 28 órán át tenyésztett kultúrával oltjuk be, és a tenyészetet 190 fordulat/perc sebességgel keverjük. A tenyészetbe 2500 liter/perc sebességgel steril levegőt vezetünk, és a tenyésztést 24 °C-on végezzük. 65 óra elteltével a tenyésztést leállítjuk. A tenyészet pH-ja ekkor 7,5. Az elegyhez 77.5 kg dikalitot adunk, présszűrőn szűrjük, és a szűrőlepényt 200 liter vízzel mossuk. A szűrletet és a mosófolyadékot egyesítjük, és a 2790 liter folyadékot 3 n nátriumhidroxid-oldattal pH = 8,2 értékre lúgosítjuk. Az oldatot 1400 liter n-butanollal extraháljuk. A pepszingátló hatás vizsgálatával megállapítottuk, hogy a szűrlet 423 g pepsztatint, míg a butanolos oldat 362 g pepsztatint tartalmaz. A butanolos oldatot csökkentett nyomáson 105 literre bepároljuk, és a csapadékot elkülönítjük. A csapadék nedves súlya 3670 g. A betöményített oldatot 10 liter végtérfogatra bepároljuk, és az 1540 g nedves súlyú csapadé-5 kot elkülönítjük. A két bepárlás során kapott csapadékot egyesítjük, és kb. 40 °C-on 16 liter metanolban oldjuk. A metanolos oldat 297 g pepsztatint tartalmaz. A meleg metanolos oldathoz 1500 g aktív szenet adunk, majd szűrjük. A 10 metanolos oldatot lehűtjük, és a kivált kristályokat kiszűrjük. 400 g nedves súlyú kristályos terméket kapunk. Az aktív szenet 3x8 liter forró metanollal mossuk, az így kapott metanolos oldatot a fenti kristályosítás anyalúgjával egyesít-15 jük, 1 literre betöményítjük és lehűtjük. 63 g kistályos pepsztatint kapunk. A dikalitot tartalmazó micéliumlepényt 500 liter forró metanollal extraháljuk, és a metanolos oldatot vákuumban bepároljuk. A maradékot 15 20 liter forró etanollal mossuk, majd 20 liter forró metanolban oldjuk. Az oldathoz 1000 g aktív szenet adunk, majd kiszűrjük, a metanolt 1 liter végtérfogatra bepároljuk és fokozatosan lehűtjük. 170 g kristályos pepsztatint kapunk. 25 8. példa Kb. 50 ml metanolban 548 mg pepsztatint oldunk, és az oldathoz a diazometán sárga színé-30 nek állandósulásáig 3 g/200 ml koncentrációjú éteres diazometán-oldatot adunk. Az elegyet azonnal bepároljuk vákuumban. 560 mg fehér port kapunk, amely metanolos átkristályosítás után 249—251 °C-on olvadó fehér tűkristályokat 35 képez. A termék infravörös spektrumában 1730 cm_1 -nél észtersav jelenik meg, és a pepsztatin karboxil-csoportjára jellemző 1710 cnrMiez tartozó sáv eltűnik. A kapott termék 0,015 /<g/ml koncentrációban fejt ki 50%-os gátló hatást. 40 9. példa 2,5% glicerint, 0,5% húskivonatot, 0,5% peptont, 1,0% élesztőkivonatot, 0,2% NaCl-t, 0,05% 45 MgSO,,7H2 O-0t, 0,05% K 2 HP0 4 -ot és 0,32% CaCO3-0t tartalmazó táptalajhoz platinakacsnyi mennyiségű Streptomyces argenteolus var. toyonakensis MC210—Al törzsből származó spórákat és micéliumot adunk. A beoltás előtt 100 ml 50 táptalajt 500 ml-es lombikban sterilizálunk. A beoltott táptalajt 7 napig 27 °C-on rázás közben tenyésztjük. Az elegy pH-ja a tenyésztés ötödik napján 7,5, hetedik napján 7,7. 0,1 ml 25-szörösére hígított szűrt fermentlé 32%-os pepszin-55 gátló hatást fejt ki. Az 50 lombikban található tenyészetet egyesítjük, szűrjük és 2000 liter n-butanollal extraháljuk. A butanolos oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk. 2,0 g barna port kapunk, amely 1,5 <"g/ml koncentrációban 60 fejt ki 50%-os pepszingátló hatást. A nyers port 30 ml vízben szuszpendáljuk és 18 g aktív szenet tartalmazó, 1,5 cm átmérőjű oszlopon bocsátjuk keresztül. Az oszlopot 300 ml 30%-os vizes metanollal mossuk, majd a pepsztatint 80 %-os vi-65 zes metanollal eluáljuk. Az eluátumot 5 g-os frak-
