161558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív pepsztatin előállítására
17 161558 18 A pepsztatin nem rendelkezik papaingátló hatással (a papain szulfhidril-hatócsoportot hordoz), azonban jelentős mértékben gátolja a carrageenin-ödémát (C. A. Winter, E. A. Risley és G. W. Nuss: Proc. Soc. Exp. Biöl. & Méd. III, 544, 1962). A pepsztatint intraperitöneális injekció formájában adtuk be. A patkány hátsó lábába 0,1 ml 1%-os carfageeninoldatot fecskendeztünk be, majd 1, 3, 5 és 24 óra elteltével megvizsgáltuk az ödémát. Legalább 1,25 mg/kg mennyiségű pepsztatin beadásával legalább 30%-os gátló hatást érhetünk el. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. Tekintettel arra, hogy a pepsztatin tulajdonságait és hatásterületeit megfelelő részletességgel ismertettük, és feltételezésünk szerint a savas proteázok hidrolízisét gátló hatású pepsztatint igen sok Streptomyces törzs termeli, a következőkben közlendő eljárási lépéseket széles körben változtathatjuk. A találmány oltalmi köre mindezeket a változtatásokat is magában foglalja, és kiterjed a pepsztatin előállítására, betöményítésére, kivonására, tisztítására, valamint a biológiailag aktív pepsztatin-észterek előállítására is. 1. példa 100 ml táptalajt 500 ml-es forgatható lombikba helyezünk, és 20 percig 120 °C-on sterilizáljuk. A táptalaj 1,0% glükózt, í\0% keményítőt, 0,75% peptont, 0,75% húskivonatot, 0,3% NaCl-t, 0,1% MgS0.7H2 0-t, 0,1% KaHPO/.-ot és 0,1 ml fémsóoldatot (100 ml desztillált vízben oldott 700 mg CuS04 .5H 2 0, 100 mg FeS0 4 .7H 2 0, 800 mg MnCl2 .4H 2 0, 200 mg ZnSO/,7H 2 0) tartalmaz. A táptalaj pH-ját sterilizálás után 7,0-ra állítjuk be. A táptalajt platinakacsnyi, agáron tenyésztett Streptomyces testaceus MC 144—Cl törzs spóráival és micéliumával oltjuk be, és rázógépen (8 cm amplitúdó, 130 löket/perc) 27 °C-on tenyésztjük. A rázott tenyészet pH-ja a tenyésztés harmadik napján 5,7, míg a negyedik napon 6,3 volt. A redukáló cukor mennyiségét antronmódszerrel határoztuk meg. Az optikai sűrűség az első nap 0,9/0,005 ml, a negyedik nap 0,3/0,005 ml, míg az ötödik nap csaknem nulla volt. A tenyészetet az ötödik napon szűrjük és megvizsgáljuk pepszingátló hatását. 0,05 ml százszorosára hígított szűrlet 64%-os pepszingátló hatást fejt ki. A tenyésztés ötödik napján a 29 lombikban található tenyészetet egyesítjük, szűrjük, és a szűrletet 2400 ml, majd 2000 ml n-butanollal extraháljuk. A butanolos oldatokat egyesítjük, és csökkentett nyomáson bepároljuk. 4 g nyers, barna port kapunk, amely 0,13 Mg/ml koncentrációban fejt ki 50%-os pepszingátló hatást. 2. példa / Az 1. példában leírt eljárással kapott nyers, por alakú pepsztatin tisztítását ismertetjük. Kiindulási anyagként olyan nyers port használunk fel, amely 0,16 j"g/ml koncentrációban fejt ki 50%-os pepszingátló hatást. 2,1 g nyers port 30 ml desztillált vízben oldunk, és az oldatot 2 ml/perc sebességgel 72 cm hosszú, 18 g aktív 5 szenet tartalmazó oszlopon bocsátjuk keresztül. Az oszlopot 400 ml desztillált vízzel és 300 ml 40%-os vizes metanollal mossuk, és a pepsztatint 80%-os vizes metanollal (metanol 9 víz = 80:20) eluáljuk. 10 Az eluátumot frakciókba gyűjtjük. Az 5 g-os frakciók közül a pepsztatint tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és vákuumban bepároljuk. 0,7 g fehér, por alakú terméket kapunk, amely 0,054 ,"g/ml koncentrációban fejt ki 50%-« 15 pepszingátló hatást. 3. példa Az 1. példában leírt módon 4000 ml szűrt fer-20 mentlevet állítunk elő. 0,05 ml százszorosára hígított szűrlet 58%-os pepszingátló hatást fejt ki. A szűrlethez 80 g aktív szenet adunk, és 20 percig keverjük. Ekkor a szűrletben levő összes pepsztatin adszorbeálódik. Az aktív szenet ki-25 szűrjük, 2000 ml vízzel mossuk, és a pepsztatint 40 °C-on 2000 ml, majd 1500 ml metanollal eluáljuk. A metanolos oldatokat egyesítjük és vákuumban benárolji.'?. 15 g nyers, barna port kapunk, amely 0,6 ,"g/ml koncentrációban fejt ki 30 50%-os pepszingátló hatást. A kapott port 1000 ml vízben oldjuk, és 100 g aktív szenet tartalmazó, 3 cm átmérőjű oszlopon bocsátjuk keresztül. A kromatografálást a 2. példában leírt módon hajtjuk végre. 1,5 g fehér port kapunk, 35 0,054 «g/ml koncentrációban fejt ki 50%-os pepszingátló hatást. 4. példa 40 A következőkben a pepsztatin teljes tisztítását ismertetjük. 0,38 g, a 3. példában leírt módon előállított, fehér porból indulunk ki, amely 0,06 «g/ml koncentrációban fejt ki 50%-os pepszingátló hatást. A port 5,0 ml 4:1:1:4 térfogatará-45 nyú butanol-ecetsav-víz-butilacetát elegyben oldjuk, és 90 g szilikagélt tartalmazó, 2,2 cm átmérőjű oszlopon bocsátjuk át. A szilikagél oszlopot előzetesen átöblítjük az oldószereleggyel. Eluálószerként a fenti összetételű oldószerelegyet alkal-50 mázzuk, és 5 g-os frakciókat gyűjtünk össze. A pepsztatin a 9—15. frakciókban jelenik meg. Ezeket a frakciókat egyesítjük és bepároljuk. 0,27 g fehér port kapunk, amely 0,04 ,«g/ml koncentrációban fejt ki 50%-os gátló hatást. A ka-55 pott port metanolból kristályosítjuk. 0,13 g tűs, kristályos pepsztatint kapunk, amely 0,02 f*g/ml koncentrációban fejt ki 50%-os pepszingátló hatást. 60 5. példa 0,4 g, a 2. példában leírt eljárással előállított fehér pórból indulunk ki, amely 0,06 ,"g/ml koncentrációban fejt ki 50%-os pepszingátló hatást. 65 A port 5,0 ml 3:1 arányú etilacetát-metanol
