161558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív pepsztatin előállítására
13 kromatografálással tisztíthatjuk. Eljárhatunk pl. úgy, hogy a pepsztatint szénen adszorbeáljuk, majd az adszorbenst 40%-os vizes metanollal (metanol : víz=40 : 60) mossuk, végül 80%-os metanollal (metanol : víz=80 : 20) eluáljuk. Az aktív szén segítségével a színes szennyezőanyagokat is eltávolíthatjuk. A pepsztatint szilikagélen végzett kromatografálással is tisztíthatjuk. Ebben az esetben eluálószerként pl. 4:1:1:4 térfogatarányú n-butanol-ecetsav-víz-butilacetát elegyet vagy 3:1 térfogatarányú etilacetát-metanol elegyet alkalmazhatunk. A tisztításhoz adszorbensként alumíniurnoxidot is felhasználhatunk. Az utóbbi esetben eluálószerként pl. metanolt, etanolt, butanolt vagy a felsorolt alkoholok észterekkel készített elegyeit alkalmazhatjuk. Tekintettel arra, hogy a pepsztatin karboxilcsoportot tartalmaz, a pepsztatin kivonását és tisztítását erősen vagy gyengén bázikus ioncserélő gyantákkal is végrehajthatjuk. A pepsztatin könnyen kristályosítható. A kristályosításhoz olyan oldószereket — pl. metanolt — alkalmazunk, amelyekben a pepsztatin oldódik. A pepsztatin karboxil-csoportja a szokásos észterképzési módszerekkel — pl. sav jelenlétében a megfelelő alkohollal hevítve, vagy diazometán felhasználásával — észteresíthető. A pepsztatin észterei ugyancsak pepszingátló hatást fejtenek ki. A pepsztatin-metilészter pepszingátló hatása erősebb a pepsztatin-alapvegyületnél. Ha a fermentációs eljárás során nagy hozammal képződik pepsztatin, a pepsztatint igen könynyen kristályos termékké alakíthatjuk. Ha a pepsztatint butanollal kivonjuk, majd a butanolos oldatot vákuumban bepároljuk, kristályos terméket kapunk, amelyet metanolból átkristályosítva tovább tisztíthatunk. A pepsztatin fehér tűkristályokat képez. A következőkben a pepsztatin fizikai tulajdonságait ismertetjük. A pepsztatin fehér tűkristályokat képez, az általunk előállított legtisztább pepsztatin 228—229 °C-on olvad. A pepsztatin optikailag aktív vegyület, forgatóképessége 0,288%-os metanolos oldatban: [a]^=—90°. A A pepsztatin elemzési adatai a következők: C34HB3 N 3 O u képletre: Számított: C=59,53% H=9,25% N=10,21% 0=20,99% Talált: C=60,27% H=9,27% N=10,ll% 0=21,41% Az elemzési adatok alapján a pepsztatin tapasztalati képlete C35H65N5O10 (számított értékek: C = 58,72%, H = 9,15%, N = 9,78%, 0 = 22,35%), ill. C35H65N5O9 (számított értékek: C = 60,06%, H = 9,36%, N = 10,01%, O = 20,57%) lehet. A tömegspektroszkópiai vizsgálat a C34H63N5O9 képletet támasztja alá. A diacetil-pepsztatin-metilészter csúcsértéke 783, míg a pepsztatin-metilészter csúcsértéke 699. Akiya— Berger módszerével, piridines oldatban, a pep-161558 14 sztatin molekulasúlya 600—730 közötti értéknek adódott. A pepsztatin infravörös spektrumát az 1. ábra mutatja be. A spektrumban a következő hullám-5 számértékeknél jelennek meg sávok': 3320, 3090, 2955, 1710, 1635, 1545, 1450, 1420, 1390, 1370, 1300, 1220, 1178, 1070, 710 cm"1 . A pepsztatin-metilészter infravörös spektrumát a 2. ábrán tüntettük fel. A 3. ábra a diacetil-pepsztatin-metil-10 észter magmágneses rezonanciaspektrumát mutatja be. A spektrumot Varian HA—100 készüléken, tetradeuterometanolban vettük fel, belső standardként trirnetilszilánt alkalmaztunk. Ha a pepsztatint 18 órán át, 100 °C-on 6 n só-15 savoldattal kezeljük, hidrolízistermékként 1:2 arányban L-alanint és L-valint kapunk. A pepsztatin pozitív Rydon—Smith-reakciót ad. Ezek az eredmények, valamint az infravörös spektrumban 1635 és 1545 cm"i-nél fellépő sávok azt iga-20 zolják, hogy a pepsztatin peptidkötéseket tartalmaz. Az infravörös spektrumban 1710 cm_1 -nél megjelenő sáv a pepsztatin karboxil-csoportjának jellemző sávja. A pepsztatin karboxil-csoportját 25 az is igazolja, hogy a pepsztatin anioncserélő gyantákon adszorbeálódik. Ha a pepsztatint diazometánnal kezeljük, vagy kénsav és alkohol elegyében melegítjük, a megfelelő észterekhez jutunk. A pepsztatin metilészterének infravörös 30 spektrumában az 1710 cm_1 -nél megjelenő sáv helyett 1730 cm_1 -nél lép fel észtersáv. A pepsztatin-metilészter elemzési adatai a következők: C35 H Ö5 N 5 09 képletre: 35 Számított: C = 60,05% H = 9,36% N = 10,00% O = 20,57% Talált: C = 59,88% H = 9,35% N = 9,74% O = 20,69% 40 Tekintettel arra, hogy a pepsztatin karboxilcsoportot tartalmaz, sókat képez. A sók a sav semlegesítésével állíthatók elő, vagy úgy, hogy a pepsztatin metanolos oldatához számított meny-45 nyiségű bázist adunk. A fenti eljárással pl. a következő sókat állítottuk elő: Pepsztatin-nátriumsó, o. p.: 250—252 °C (bomlás), C34H 62 N 5 0 9 Na: 50 Számított %: C = 57,68 H = 8,82 N = 9,89 O = 20,34 Na = 3,24 Talált %: C = 57,97 H = 8,92 N = 9,96 0 = 20,26 Na =2,98. Pepsztatin-magnéziumsó, o. p.: 257—258 °C (bomlás), C3 4H 62 N 5 09 V 2 Mg: 60 Számított %: C = 58,58 H = 8,96 N = 10,04 0 = 20,65 Mg = 1,74 Talált %: C = 58,30 H = 9,05 N = 9,94 O = 20,84 Mg = 1,49
