161542. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B-5050 antibiotikum-komplex és a komplex egyes komponenseinek előállítására

161942 19 500 mg, főtömegében B—5050—A antibiotikumból álló kristályos terméket 1,5 ml etilacetátban oldunk, és az oldatot 50 g szilikagél oszlopon (a fentivel azonos minőségű termék) kromatograiáljuk. Az antibiotikumot 1:1 térfogatarányú etilacetát :benzol eleggyel eluáljuk, és az eluátumot frakciókba gyűjtjük. Minden frakció hatóanyag-tartalmát megvizsgáljuk. A vizsgálatot szilikagél vékonyrétegen (HF25/,, a Merck A. G., Darmstadt, NSZK cég terméke) végezzük, eluálószerként 3:2 térfogatarányú benzol:aceton elegyet alkalmazunk. A hatóanyagként kizárólag B—5050—A antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk, és a maradékot benzolból átkristályosítjuk. Színtelen, prizmás kristályok alakjában 88,5 mg B—5050— —A antibiotikumot kapunk. 350 g, főtömegében B—5050—F antibiotikumból álló kristályos terméket 50 g szilikagélen (a fentivel azonos minőségű termék) oszlopkromatográf iának vetünk alá. Az oszlopot 700 ml 2:1 térfogatarányú etilacetát :benzol eleggyel eluáljuk, majd az eluátumfrakciókat vékonyréteg-kromatográfiásán megvizsgáljuk. Eluálószerként 3:1 arányú etilacetát: :benzol elegyet alkalmazunk. A hatóanyagként kizárólag B—5050—F antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk, és a maradékot átkristályosítjuk. 75,6 mg színtelen, prizmás kristályos B—5050—F antibiotikumot kapunk. 2. példa 2 literes Sakaguchi-lombikokba töltött, 500— 500 ml, az 1. példában ismertetett összetételű, steril táptalajt Streptomyces hygroscopicus IFO —12995 tenyészettel oltunk be, és a beoltott lombikokat az 1. példában ismertetett körülmények között inkubáljuk. 500 literes rozsdamentes acélfermentorba 200 liter, az 1. példában ismertetett összetételű oltótenyészet-táptalajt töltünk. A táptalajt 20 percig 121 °C-on sterilizáljuk, majd 2 liter, fenti módon előállított előtenyészettel beoltjuk. Az elegyet 24 órán át 28 °C-on, 200 liter/perc sebességű levegőztetés és 200 fordulat/perc sebességű keverés közben inkubáljuk. 6000 literes rozsdamentes acélfermentorba 4000 liter, a fentivel azonos összetételű f őtenyészettáptalajt töltünk, és a táptalajhoz 200 liter, fenti módon előállított oltótenyészetet adunk. Az elegyet 28 °C-on, 2400 liter/perc sebességű levegőztetés és 180 fordulat/perc sebességű keverés közben 48 órán át inkubáljuk. Az inkubáció alatt az elegyhez Actocol habzásgátlót adunk. A tenyészetet szűrjük, a 4000 liter szűrt tenyészetet 2 n nátriumhidroxid-oldattal pH =9 értékre lúgosítjuk, 1330 liter etilacetáttal extraháljuk, és az etilacetátos oldatot vízzel mossuk. A kapott 1052 liter etilacetátos oldatot vákuumban 100 liter végtérfogatra bepároljuk. A tömény oldatot 2x50 ml foszforsawal pH= 4 értékre savanyított, 0,667 m káliumdihidrogénfoszfát-oldattal extraháljuk. A kivonatokat egyesítjük, híg vizes ammóniumhidroxid-oldattal pH 20 = 8,5 értékre lúgosítjuk, és 50 liter etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos oldatot vízzel mossuk, szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A szirupszerű maradékhoz 3 liter n-hexánt adunk. 5 330 g por alakú nyersterméket kapunk. 300 g por alakú nyersterméket 1,1 liter benzolban oldunk melegítés közben, és az elegyet lehűtjük. 117 g kristályos, főtömegében B—5050—C, B—5050—D és B—5050—E antibiotikumból álló 10 elegyet kapunk. Egy másik eljárásváltozat szerint a foszfátoldat extrahálásával kapott etilacetátos oldatot 2x50 liter 0,005 n kénsavoldattal extraháljuk. A 15 vizes oldatokat egyesítjük, híg vizes ammóniumhidroxid-oldattal pH — 8 értékre lúgosítjuk, és 3x30 liter etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos oldatokat egyesítjük, vízzel mossuk, szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A szirupszerű 20 maradékhoz 1,5 liter n-hexánt adunk. 160 g por alakú nyersterméket kapunk. 150 g por alakú nyersterméket forró benzolból átkristályosítunk. 72,5 g kristályos, főtömegében B—5050—A és B-—5050—B antibiotikumot, és kis mennyiségű 25 B—5050—C antibiotikumot tartalmazó elegyet (II. kristályelegy) kapunk. Az elegyet a hatkomponensű B—5050 antibiotikum vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatánál ismertetett a) vagy c) módszerrel bontjuk komponenseire. A II. kris-30 tályelegy vékonyréteg-kromatogramjában két folt jelenik meg, amelyek Rrértéke az a) módszer szerint 0,48 és 0,54, ill. a c) módszer szerint 0,66 és 0,71. 2,0 g II. kristályelegyet 20 ml etilacetátban ol-35 dunk, és az oldathoz 14 ml benzolt adunk. Az oldatot 1:1 térfogatarányú benzol:etilacetát elegygyel telített szilikagél oszlopon (szemcseméret: 0,05—0,2 mm, a Merck A. G. Darmstadt, NSZK cég terméke) kromatografáljuk. A kromatogra-40 mot 1:1 térfogatarányú etilacetát:benzol elegygyel kifejlesztjük, 200 ml eluátumot elkülönítünk, majd az oszlopot 3:2 térfogatarányú etilacetát :benzol eleggyel eluáljuk, és az eluátumot frakciókba gyűjtjük. Ezek a frakciók Bacillus 45 subtilis-szel szemben antimikróbás hatást fejtenek ki. Az azonos komponenseket tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk, és benzolból átkristályosítjuk a maradékot. 435 mg kristályos B—5050—A antibiotikumot és 185 mg kristályos 50 B—5050—B antibiotikumot kapunk. 10 g I. kristályelegyet 50 ml etilacetátban oldunk, és az oldathoz 25 ml benzolt adunk. Az oldatot a fent ismertetett módon 400 g szilikagélen kromatografáljuk. Az oszlopot először 3 liter 55 1:1 térfogatarányú etilacetát :benzol eleggyel, majd 2:1 térfogatarányú etilacetát:benzol elegygyel eluáljuk. Az eluátumot 500 ml-es frakciónként gyűjtjük össze. Az 1:1 térfogatarányú oldószereleggyel kapott eluátum tartalmazza a B— 60 —5050—A és a B—5050—B antibiotikumot. A 2:1 térfogatarányú oldószereleggyel kapott első eluátumfrakció B—5050—B és B—5050—C antibiotikumot, a második eluátumfrakció B—5050—D és B—5050—C antibiotikumot, a harmadik frak-65 ció B—5050—D és B—5050—E antibiotikumot, és