161523. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-béta 3,4-dihidroxi-fenilalanin előállítására fermentálással

161523 oncserélő műgyantán az L. E. MARTIN és C. HARISSON [Anal. Biochem. 23, 529 (1968)] által leírt módon és alumíniumoxidon etiléndiamin tetraecetsav és nátriummetabiszulfit jelenlétében A. H. ANTON és D. E. SAYRE [J. Pharmacol. Exp. Therap. 145, 326 (1964)] módszere szerint. Az alumíniumoxidon rögzített L-DOPA oxálsavoldattal eluálható, és az oxálsav eltávolítása után átkristályosítással tisztítható. A következő példák szemléltetik a találmány gyakorlati végrehajtását korlátozás szándéka nélkül. 1. példa Egy 30 literes fermentorba betömjük a következő anyagokat: 6 2. példa élesztőkivonat 40 g pepton 80 g húskivonat 80 g glukóz-monohidrát 160 g nátriumklorid 80 g csapvízzel kiegészítve 17 literre. A pH-t 22 ml 10 n nátriumhidroxid-oldat hozzáadásával beállítjuk 7,5-re. 40 percig 122 °C-on sterilizáljuk a táptalajt. Lehűlése után a táptalaj térfogata 16 liter és a pH-ja 6,95. Ezután beoltjuk Vibrio tyrosinaticus ATCC 19 378 200 ml rázott Erlenmeyer-tenyészetével. A tenyészetet keverés és steril levegővel va'Ió levegőztetés közben 26 °C-on 16 óra hosszat inkubáljuk; ekkor alkalmas a kívánt átalakítás végrehajtására. Az átalakítást 5,3 pH-nál végezzük. A tenyészet pH-j át beállítjuk erre az értékre 2,4 n steril sósav hozzáadásával, és hozzáadunk 64 g tirozint két azonos térfogatú steril oldat ailakjában, az egyik 20%-os 2,4 n sósavban és a másik szintén 20%-os 2,4 n nátriumhidroxid-oldatban. Ezután hozzáadunk 350 ml 160 g glukóz-monohidrátot tartalmazó steril oldatot, és a tenyésztést 27 óra hosszat folytatjuk, szükség esetén a pH-t időnként 5,3-ra beszabályozva. A végső térfogat 14 litere 3, 0 g/liter L-DOPA. A fermentlé L-DOPA tartalmát a szüredékéből határozzuk meg 2 pH-nál az L. E. ARNOW [J. Biol. Chem. 118, 531 (1937)] által leírt módszer szerint. Az oldat színét spektrofotométeren hasonlítjuk össze egy tiszta L-DOPA minta színével. Ennek az L-DOPÁra nem specifikus meghatározásnak az ellenőrzésére a szüredéket vékony cellulózrétegen kromatografáljuk 7:3 térfogatarányú propanol-víz vagy 5:1 térfogatarányú izopropanol—0,1 n sósav rendszerben, majd a kromatogramot káliumcianoferrát(III)mal és etiléndiaminnal előhíva spektrofotometriailag meghatározzuk az L-DOPÁt. Az ezzel a két módszerrel kapott titerek jól egyeznek egymással. Az 1. példa szerint kapott,, 5,4 g L-DOPÁt tartalmazó 1,8 liter átalakulási közeget 50 ml 12 n 5 sósavval megsavanyítunk 2 pH-ra, majd centrifugáljuk. A folyékony fázist átbocsátjuk egy 7,5 cm átmérőjű és 63 cm magas savfázisban levő DOWEX 50 W—X 2 oszlopon (2% divinilbenzolt tartalmazó polisztirol-szulfonsav alapú mű-10 gyanta, miililiterenként 0,9 milliegyenérték és grammonként 5,3 milliegyenérték száraz műgyanta tartalommal). Az adszorbeált L-DOPÁt 2 n sósavval eluáljuk. Az 5,2 liter eluátumot, amely még egy kevés átalakulatban tirozint tar-15 talmaz, megtisztítjuk oly módon, hogy a pH-iát 800 ml nátriumhidroxid-oldat (d = 1,33) hozzáadásával beállítjuk 4,0-ra,i és hozzáadunk 250 g alumíniumoxidot, 5 g nátriummetabiszulfitot, és 5 g etiléndiamintetraecetsavas nátriumot. A 20 keveréket keverjük, pH-ját 200 ml tömény nátriumhidroxid-oldattal (d = 1,33) beállítjuk 8,6-ra, majd 15 percig állni hagyjuk. Az alumíniumoxidot szűréssel elválasztjuk, és több ízben öszszesen 3 liter desztillált vízzel mossuk. A tiro-25 zint tartalmazó szüredéket és mosófolyadékokat kiontjuk, az L-DOPÁt pedig az alumíniumoxidot 2,2 liter 2 n oxálsav-oldattal kezelve elválasztjuk. Az oxálsavas oldatot forrásban levő vízfürdőn 30 torr nyomáson melegítve bepároljuk 0,7 literre, és a kikristályosodott oxálsavat szűréssel eltávolítjuk. Ezután a szüredékhez 3,7 liter etilalkoholt adunk, és 150 ml nátriumhidroxid-oldattal (d = 1,33) a szervetlen sók kiválasztására beállítjuk 5,5 pH-ra. A kiválasztás teljessé tételére még hozzáadunk 3,7 liter acetont. A képződött csapadékot azonnal szűrőre visszük, és a szüredéket forrásban levő vízfürdőn 30 torr nyomáson bepároljuk 0,8 literre. A 4Q bepárlást atmoszférikus nyomáson fejezzük be nitrogén alatt paraffinfürdőben, és az így kapott 70 ml oldatból 4 °C-on való 10 órai állás után szűréssel 2,54 g nyers L-DOPÁt kapunk. A kristályosítási anyalúgot koncentrálva még 45 0,65 g kristályos terméket nyerhetünk. Az így kapott nyersterméket vizes oldatának aktív szénnel való elszíntelenítése után kikristályosítva 2,65 g kristályos L-DOPÁt kapunk 49% hatásfokkal a fermentleben meghatározott 50 L-DOPÁhoz viszonyítva. [a]n = —16,4 + 0,8" (c = • 1, 0,1 n sósavban). A terméket vékony cellulózrétegen 70:30 térfogatarányú propanol-3 n sósav rendszerrel kromatografálva és a-nitrozo-/?-naftollal előhíva [R. 55 ACHER és C. CROCKER, Biochim. Biophys. Acta 9, 704 (1952)] tirozintól mentesnek találjuk. 3. példa 60 Egy 75 literes fermentorba betöltjük a következő anyagokat: 30 35 65 élesztőkivonat húskivonat pepton 100 g 200 g 200 g 3