161523. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-béta 3,4-dihidroxi-fenilalanin előállítására fermentálással

3 timális pH-értékkel, célszerű a tenyésztést két fokozatban végezni. Az első fokozatban a Vibrio tyrosinaticus ATCC 19 378-at 6,0-nál nagyobb pH-értékű alkalmas táptalajban tenyésztjük, majd a második fokozatban a tenyészet pH-jának a legkedvezőbb pH-tartományba való esetleg szükséges beállítása után hozzáadjuk a tenyészethez a tirozint, és elvégezzük az átalakítást. A Vibrio tyrosinaticus ATCC 19 378 tenyésztésére bármely ismert aerob felszíni vagy sülylyesztett tenyésztési módszer alkalmas, noha az utóbbi kényelmességénél fogva előnyösebb. Erre a célra az erjesztési iparban használatos különféle típusú készülékek alkalmazhatók. Előnyösen a műveleteket a következő sorrendben végezzük: Vibrio tyrosinaticus ATCC 19 S"^ I v tenyésztés agáron I * tenyésztés rázott lombikban I termelő tenyésztés fermentorban A fermentációs közeg változhat, de mindig tartalmaznia kell egy asszimilálható szénforrást, egy asszimilálható nitrogénforrást, szervetlen elemeket és adott esetben növekedési faktorokat. Mindezek az anyagok lehetnek jól definiált termékek vagy összetett keverékek, amelyek különféle eredetű biológiai termékekként találhatók. Asszimilálható szénforrásként felhasználhatók szénhidrátok., mint a glukóz, maltóz, dextrinek, keményítő, glicerin és más hasonló termékek, mint a melasz. Bizonyos állati vagy növényi eredetű olajok, például lardolaj vagy szójaolaj is alkalmasak a szénhidrátok helyett vagy kiegészítésükre. Az alkalmas nitrogénforrások rendkívül sokfélék. Ezek lehetnek igen egyszerű vegyületek, mint az ammónium sói, a karbamid és bizonyos aminosavak. Ugyancsak felhasználhatók bonyolultabb nitrogéntartalmú anyagok is, mint a kazein, laktalbumin, siker és hidrolizátumaik, szójababliszt, földimogyoróliszt, halliszt., húskivonat, élesztőkivonat, szeszmoslék, kukoricalekvár. A szervetlen adalékok részben pufferoló vagy közömbösítő hatásúak, lehetnek, mint amilyen az alkáli- vagy földalkálifoszfátok vagy a kalcium- vagy magnéziumkarbonát. Másokra a Vibrio tyrosinaticus ATCC 19 378 fejlődéséhez szükséges ionegyensúly miatt van szükség, ilyenek az alkáli- és földalkálikloridok és -szulfátok. Végül mások a Vibrio tyrosinaticus anyagcseréjét aktiválják, ilyenek a cink-, kobalt-, vas-, réz- és mangánsók. A fermentációs közeg pH-jának a tenyésztés megindulásakor 6.0—7,8-nak, előnyösen 6,5—7,5-nek kell lennie. Az így előkészített táptalajt be-4 oltjuk a Vibrio tyrosinaticus ATCC 19 378 törzs folyékony tenyészetével, és keverés és levegőztetés közben 22 és 37 °C, előnyösen 25 és 26 °C között inkubáljuk. A levegőztetés mértéke elég 5 széles határok között változhat. Azt találtuk azonban, hogy a táptalaj literére számítva percenként 0,3—3 liter levegő a legalkalmasabb. A második fokozatban, amikor az L-DOPA képződése végbemegy, a tenyészethez hozzáír adunk literenként 0,1—15 g, előnyösen 3—10 g kereskedelmi minőségű L-tirozint. Az L-tirozint szilárd állapotban vagy oldat alakjában adhatjuk a tenyészethez annak különböző fázisaiban, előnyösen 16—24 órai inkubálás után. A tirozin oldására savakat vagy bázisokat használva viszonylag koncentrált oldatok állíthatók elő. Előnyös egyidejűleg egy sósavas tirozin-oldatot és egy nátriumhidroxidos tirozin-oldatot a közeghez hozzáadni, mert a két oldatot kellő arányban alkalmazva egyrészt kellő mennyiségű tirozint juttathatunk a tenyészetbe, másrészt beállíthatjuk a pH-t anélkül, hogy jelentősen megnövelnénk a közeg szervetlensó-tartalmát. 2g A hozzáadás után függetlenül attól, hogy mikor és mennyi tirozint adtunk a közeghez, a keverést' és a hőmérsékletet 1—2 napig fenntartjuk, hogy maximális L-DOPA termelést érjünk el. 30 Előnyös lehet, ha a tenyészethez az átalakítás kezdetén, vagyis rögtön a tirozin hozzáadása után literenként 2—20 g glukózt adunk, amely egyrészt a mikroorganizmus energiaforrásaként szolgál, másrészt hozzájárul a tenyészet pH-já-35 nak szabályozásához,, megakadályozva annak 6,0 értéken túl való növekedését, ami előnytelen lenne mind a tirozin átalakulására, mind a már képződött L-DOPA stabilitására nézve. Előnyös lehet az is, ha a L-tirozinnak L-DOPÁ-40 vá való átalakítását aszkorbinsav jelenlétében hajtjuk végre. Az aszkorbinsavat általában a mikroorganizmus tenyésztése után és az L-tirozin hozzáadása előtt, közben vagy után adjuk a közeghez. Ez lehetővé teszi kedvező hozam fenn-45 tartását még akkor is, ha a pH az átalakulás során 6 és 7 között van. Ilyen körülmények között általában nem szükséges többé a tenyészet pH-ját beállítani az L-tirozinnak L-DOPAvá való átalakítása előtt. 50 Az aszkorbinsav hozzáadását egy vagy több adagban végezzük, és a koncentrációja literenként 1—5 g. Végül az átalakulásra előnyös hatása van a következő adalékoknak: 55 rézsók literenként 1—10 mg mennyiségben, antioxidánsok, például szorbinsav, N,N'-difenil-parafeniléndiamin, 2-(vagy 3)-terc.-butil-4--metoxifenol, 2„6-di-terc.-butü-parakrezol és különösen 2,2,4-trimetil-6-etoxi-l ,2-dihidroxi-kino-60 lin literenként 0,1—1 g mennyiségben. Az L-DOPA a fermentléből ismert módon extrahálható. Például a fermentlevet 2 pH-ra megsavanyítjuk, majd szűréssel vagy centrifugálással derítjük. Ezután az L-DOPÁt egymás után 65 adszorbeáltathatjuk egy szulfonsav típusú kati-2