161416. lajstromszámú szabadalom • Eljárás racém prosztaglandin-E-analógok előállítására
161416 47 48 belül 28 C°) 4 napig rázzuk. A tenyészetet ezután 40 ml-es centrifuga-csövekbe helyezzük és klinikai centrifugán körülbelül 2000 ford/perc sebességgel centrifugáljuk. A centrifugacsövekből a folyadékot dekantáljuk és az összegyűjtött sejteket hideg vízzel mossuk. Két centrifugacsőből a mosott sejteket 50 ml jéghideg 0,05 mólos (7,0 pH-jú) foszfát pufferben szuszpendáljuk és elhelyezzük kisméretű jéggé} hűtött Waring-keverőben. Üveggyöngyöket adunk hozzá és a szuszpendált sejteket 15 percig keverjük a keverőben. A kapott, zúzott sejteket tartalmazó szuszpenziót klinikai centrifugában szobahőmérsékleten 15 percig kb. 2000 ford/perc sebességgel centrifugáljuk, majd a szupernatans folyadékot összegyűjtjük. Ez a szupernatans folyadék Cladosporium resinae acilázt tartalmaz, és ezt közvetlenül felhasználhatjuk PG2-típusú alkilészterek hídrolizálására, vagy előnyösen fagyasztva tárolhatjuk, ameddig az szükséges. B. A racém PGE2 -metilészter észteráz-hidrolízis. A példa A. pontjában leírt módszerrel előállított Cladosporium resinae acilázt tartalmazó szupernatans folyadékból 10 ml-t és 50 mg racém PGE2 metilésztert szobahőmérsékleten nitrogén alatt rázatunk kb. 19 óra hosszat, majd 70 ml acetont adunk hozzá és az elegyet szűrjük; így szűrletet és oldhatatlan maradékot kapunk. A szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk, és így 40—50 mg kissé sárga olajat kapunk, ami racém PGE2 -t tartalmaz. Ezt az olajat és az oldhatatlan maradékot egyesítjük és 10 g savval mosott szilikagélen (Silicar CC — 4, Mallinckrodt) kromatografáljuk. Az eluálást növekvő mennyiségben etilacetátot tartalmazó hexán-izomerekkel (Skellysolve B) végezzük és 50 ml-es frakciókat gyűjtünk az alábbiak szerint: Frakció Oldószer 1. Skellysolve B 2. 40 ml Skellysolve B, 10 ml etilacetát 3. 30 ml Skellyolve B, 20 ml etilacetát 4. 25 ml Skellysolve B, 25 ml etilacetát 5. 20 ml Skellysolve B, 30 ml etilacetát 6. 10 ml Skellysolve B, 40 ml etilacetát 7. 5 ml Skellysolve B, 45 ml etilacetát 8. etilacetát 9. etilacetát 10. etilacetát 11. etilacetát 12. 100 ml etilacetát A 6. —12. frakciókat egyesítve és bepárolva racém PGE2 -t kapunk, lényegében véve a 17. példa szerint kapott anyag tulajdonságaival. A 21. példa szerinti eljárást követjük és az előbbiekben a 14. és 16. példa után meghatározott valamennyi PGE2 -típusú és 5,6-dehidro-PGE 2 -típusú vegyület metilészterét enzimatikusan a megfelelő szabad savvá hidrolizáljuk. Ugyancsak a 21. példa szerinti eljárást követjük és valamennyi PGF2 -típusú, PGA2-típusú, PGB 2 -típusú vegyület metilészterét, valamint a megfelelő 5,6-dehidro-PG2 -típusú vegyületek metilésztereit enzimatikusan a megfelelő szabad savvá hidrolizáljuk. 22. példa Racém PGF20 . és racém PGF 2ß. 5 22 mg racém PGE2 -nek 1,5 ml metanollal készített oldatához cseppenként keverés közben 0 C°-on hozzáadunk 70 mg, 5 ml jéghideg metanolban oldott nátriumbórhidridet. Ezt az elegyet 0 C°-on 30 percig keverjük, majd keverés közben 1 óra 10 alatt hagyjuk 25 C°-ra felmelegedni. Bepárlás után 10 ml vizet adunk hozzá, az elegyet 1 n sósavval megsavanyítjuk, nátriumkloriddal telítjük és ismételten etilacetáttal extraháljuk. Az egyesített kivonatokat telített, vizes nátriumklorid-oldattal 15 mossuk, szárítjuk és bepároljuk. A maradékot 3 g savval mosott szilikagélen (Silicar CC — 4) kromatografáljuk, az eluálást 50 ml etilacetáttal, majd 50 ml 1% metanolt tartalmazó etilacetáttal végezzük és 10 ml-es frakciókat gyűjtünk. A 4. és az 5. 20 frakciót egyesítjük és bepároljuk. így 11 mg racém PGF20t -t kapunk, ennek mozgékonysága szilikagélen és ezüstnitráttal impregnált szilikagél lemezen végzett vékonyréteg kromatográfia (TLC) (A —IX rendszer) szerint az optikailag ak-25 tív PGF2et mozgékonyságával azonos, a tömegspektrum-csúcsok is az optikailag aktív PGF2ot -éval azonosak. A 7.-9. frakciókat egyesítve és bepárolva 14 mg racém PGF2ß-t kapunk, ennek olvadáspontja 85—92 C°. Etilacetátból kétszer átkris-30 tályosítva 92— 93 C°-on olvadó anyaghoz jutunk, melynek mozgékonysága szilikagél lemezeken végzett vékonyréteg-kromatográfiában ugyanaz, mint az optikailag aktív PGF2g-é; a tömegspektrumcsúcsok is az optikailag aktív PGF2 g-éval azono-35 sak. 23. példa Racém 15-epi-PGF2a és racém 15-epi-PGF 2 g. 40 A 22. példa szerinti eljárást követjük és 20 mg racém lö-epi-PGEa-t nátriumbórhidriddel redukálunk. Így racém 15-epi-PGF2a -t és racém 15-epi-PGF2 p-t kapunk, melyeket Silicar CC — 4-en végzett 45 kromatográfiával választunk el, eluálásra egymás után 50, 75 és 100% etilacetátot tartalmazó Skellysolve B-t használunk. A 22. példa szerinti eljárást követve mind a racém 8-izo-PGE2 -t, mind a racém 8-izo-15-epi-50 PGE2 -t a racém 8-izo-PGF 3 és a racém 8-izo-15-epi-PGF2 «- és /3-izomerjévé redukáljuk; az a- és ßizomer párokat úgy választjuk el, ahogy azt a 22. vagy a 23. példában leírtuk. Ugyancsak a 22. példa szerinti eljárást követ-55 jük és a fentiekben meghatározott valamennyi racém PGE2 -típusú vegyületet, 5,6-dehidro-PGE 2 típusú vegyületet, 5,6-dehdro-15-epi-PGE2 -típusú vegyületet, 5,6-dehidro-8-izo-PGE2 -típusú vegyületet 5,6-dehidro-8-izo-15-epi-PGE2 -típusú vegyü-60 letet és az összes többi 5,6-dehidro-PGE2 -típusú vegyületet a megfelelő PGF2 -típusú és 5,6-dehidro-PGF2 -típusú vegyület x- és /?-izomerjévé redukáljuk. Az a- és a /3-izomereket minden esetben elválasztjuk, ahogy azt a 22. vagy a 23. példában le-65 írtuk. 24
