161252. lajstromszámú szabadalom • Eljárás csökkent allergén hatású penicillinek előállítására

11 b) A 4b példa szerint kapott 5500 ml 800 E/ml aktivitású tisztított acilázoldatot beállítottunk 4,6 pH-ra, és a ?a példában leírt módon kezeltük. 2350 ml oldatot kaptunk 1610 E/ml aktivitással. c) A 7b példa szerinti, SE Sephadex-szel tisztított 250 ml 1610 E/ml aktivitású acilázoldatot —40 C°-ra hűtöttük, és 25 C°-on 0,1—0,2 torr nyomás alatt megszárítottuk. 2,11 g tisztított acilázt kaptunk 190 000 E/g aktivitással. d) A 7b példa szerinti, tisztított 230 ml 1610 E/ml aktivitású acilázoldatot vákuumban 24 ml térfogatra koncentráltuk. Ebből a koncentrátumból 15 ml-t 15 000 E/ml aktivitással 2,5 cm átmérőjű és 100 cm hosszú Sephadex G 75 oszlopon kromatografáltunk. Az acilázt ionmentesített vízzel eluáltuk. 108 ml acilázoldatot kaptunk 1710 E/ml aktivitással. Ezt az oldatot liofilizálva 1,8 g száraz acilázt kaptunk 92 500 E/g aktivitással. e) A 7a példa szerint szulfoetil-Sephadex G50 oszlopon kapott 72 mg liofilizált acilázkészítményt feloldottuk 2,7 ml 6,30 pH értékű 0,005 mólos nátriumfoszfát pufferban, dializáltuk ugyanezzel a pufferral szemben, majd egy 13,5 cm hosszú, 0,9 cm átmérőjű, előzőleg a pufferral egyensúlyba hozott, 1 milliekvivalens/g kapacitású Whatman CM—32 karboxim etilcellulóz oszlopon kromatografáltuk. Az oszlopot a következő pufferoldatokkal eluáltuk: 0,005 mólos nátriumfoszfát puffer, pH 6,3 (kb. 17 ml); 0,02 mólos nátriumfoszfát puffer, pH 6,35 (kb. 17 ml) és 0,1 mólos nátriumfoszfát puffer, pH 6,35. 1,3 ml-es részlegeket gyűjtöttünk, és a kioltást 280 mju-nál mértük. Az összes enzim aktivitás a 0,1 mólos pufferral eluálódott, és az eredeti fehérjetartalomnak csak 10%-át tartalmazta. Az összes kioltás 90%-a hatástalan fehérje volt a 0,005 mólos pufferes részlegekben. f) A 2h példa szerint kapott 100 ml oldatot desztillált vízzel szemben, majd 24,5 óra hoszszat 6,0 pH értékű 0,005 mólos foszfátpufferral szemben dializáltuk. Az oldathoz hozzáadtunk 12,5 mg/ml ugyanazzal a pufferral egyensúlyba hozott 1,0 milliekvivalens/g kapacitású Whatman DE—32 dietilaminoetilcellulózt. Az ioncserélő cellulózt 30 perc után elválasztottuk. Az acilázaktivitás növekedése nem volt észlelhető, , de a kioltás 280 m/t-nál csak 10%-a volt az előző értéknek. Ezután az enzimaktivitást Whatman CM—32 karboximetilcellulózon adszorbeáltattuk, sóval kezeltük, és mostuk, egyensúlyig 5,5 pH értékű 0,005 mólos nátriumacetáttal. A két esetben különböző mennyiségű, 12,5 mg, illetve 3,2 mg/ml ioncserélőt használtunk. Az ioncserélő elválasztása után az ioncserélőt vízben diszpergáltuk, és a pH-t 6—7 értékre növelve 0,1 mólos foszfátpuffer hozzáadásával eluáltuk. A hozam kb. 80% volt. g) A 2h példa szerint kapott 100 ml oldatot desztillált vízzel, majd 22 óra hosszat 6,0 pH értékű 0,005 mólos foszfátpufferral dializáltuk. 12 Az oldatot 2 ízben ugyanazzal a pufferral egyensúlyba hozott 12,4 mg/ml Whatman DE— 32 dietilaminoetilcellulózzal kezeltük. Ezután az oldatot 13 mg/ml ugyanolyan, de hidroxilfázisú 5 ioncserélővel kezeltük az aciláz aktivitásának -csökkenése nélkül. Az ioncserélőt 30 perc után elválasztottuk. A pH-érték 8,31-re nőtt. Ezután az enzimet 50 mg/ml hidroxilfázisú ioncserélő hozzáadásával teljesen adszorbeáltattuk. A pH 10 9,11 volt. Az ioncserélő elválasztása és vízben való diszpergálása után az enzimet a pH-nak kb. 6 értékre való beállításával eluáltuk. A hozam meghaladta a 60%-ot, és az enzim tisztasága az aktivitás és a 280 m^-nál mért kiol-15 tás viszonya alapján számítva 20-szorosára növekedett. h) A 2c példa szerint kapott 100 ml oldatot desztillált vízzel szemben 1 óra hosszat dializálva sótalanítottuk, majd kb. 40 mg/ml 1 milli-20 ekvivalens/g kapacitású, H+ fázisú Whatman CE —32 karboximetilcellulózzal kezeltünk. Az oldat pH értékét 4,0 és 4,5 között tartottuk. Ezután az ioncserélőt elválasztottuk, és foszfátpuffer hozzáadásával a pH-értéket kb. 6-ra beállítva és az iontartalmat megnövelve az adszorbeált acilázt eluáltuk. i) Kiindulási anyagként a 2h példa szerint kapott oldatot alkalmazva megismételtük a 7a példa szerinti műveletet. 30 j) A 2c példa szerint kapott 100 ml oldatot kb. 25 mg/ml H+ fázisú Whatman CM—32 karboximetilcellulózzal, majd ugyanannyi OH— fázisú Whatman DE—32 dietilaminoetilcellulózzal részben sótalanítottuk és fehérjementesítettük. A pH értéket 5 és 7 között tartottuk. (A kezelés megismételhető, de be kell fejezni, mielőtt számottevő aciláz adszorbeálódnék). Az enzimet ezután karboximetilcellulózon adszor-40 beáltattuk, és a 7h példában leírt módon eluáltuk. k) A 2c vagy 2h példa szerint kapott 100 ml oldatot a 7j példa szerint kezeltük, de dietilaminoetilcellulóz alkalmazása nélkül. 8. példa Az aciláz-aktivitás koncentrálása és tisztítása 50 ultraszűréssel A 2c példa szerint kapot^ 10 ml oldatot a 7j példában leírt módon ioncserélővel kezelve részben sótalanítottuk • és fehérjementesítettük, de elhagytuk a karboximetilcellulózon való ad-55 szorbeáltatásból álló utolsó lépést, majd 40 ml desztillált vízzel hígítottuk, és nyomás alatt átszűrtük az 50 000-nél nagyobb molekulasúlyú molekulákat teljesen visszatartó hártyán (Diaflo hártya, gyártja Amicon Corporation, Cambridge, Mass.", Amerikai Egyesült Államok). Az aciláz 60 zömét tartalmazó 2 ml koncentrátumot liofilizáltuk. 9. példa Az aciláz-aktivitás kicsapása ammóniumszulfát-65 tal n