161252. lajstromszámú szabadalom • Eljárás csökkent allergén hatású penicillinek előállítására

161252 13 14 a) A 4b példa szerint kapott 1000 ml 358 E/ml aktivitású tisztított acilázoldathoz 570 g ammóniumszulfátot adtunk. A keveréket a só feloldódásáig kevertük. Két óra hosszat 5 C°-on való állás után a képződött csapadékot szűrőn elválasztottuk. 52,5 g nedves terméket kaptunk 5160 E/g aktivitással. b) A 9a példa szerint kapott 47,0 g 5160 E/g aktivitású nedves terméket levegőn 25 C°-on éjjelen át száradni hagytunk. Hozam 19,85 g, aktivitás 7580 E/g. 10. példa Az aciláz-áktivitás tisztítása dialízissel A 2c példa szerint kapott, 48 E/ml aktivitású acilázoldatból 11 ml-t éjjelen át ionmentesített vízzel szemben dializáltunk. A dializált oldatot az 5. példában leírt módon liofilizáltuk. Hozam <1,06 g, aktivitás 8000 E/g. 11. példa Az aciláz-aktivitás tisztítása gélszűréssel A 4b példa szerint kapott, 166 E/g aktivitású acilázoldatból 150 g-ot vákuumban bepárolva 9 ml térfogatra koncentráltunk, majd 3 cm átmérőjű és 80 cm magas Sephadex G 75 oszlopon gélszűrésnek vetettük alá, és ionmentesített vízzel eluáltunk. A kiindulási anyag 15,2%át tartalmazó 80 ml oldatban 21 200 E aktivitást kaptunk a 280 m^-on fellépő adszorpció alapján mérve. 12. példa Az E. coli aciláz lekötése polimerekre a) 2,5 ml 4%-os Sepharose 4B agaróz oldatot megszűrtünk, és az elkülönített nedves anyagot 8 percig 11,5—12,0 pH-nál 2 ml 5%-os' jéghideg vizes brómcianid oldattal kevertük. A gélt szűréssel elkülönítettük, és a szűrőn jéghideg vízzel és jéghideg 0,1 mólos bórax oldattal alaposan kimostuk. Ezután 4 ml 0,1 mólos bórax oldatban szuszpendáltuk, és 24 óra hosszat 4 C°-on a 7d példa szerint kapott 0,106 g 159 000 E/g aktivitású E. coli acilázzal kevertük. A keveréket leszűrtük, és az elkülönített anyagot a szűrőn vízzel alaposan kimosva 1,2 g nedves polimert kaptunk 679 E/g fajlagos aktivitással. b) 0,100 g Sephadex G 25-öt 8 percig 11,5— 12 pH értékben 2 ml 5%-os jéghideg vizes brómcianid oldattal kevertünk, és az oldatot megszűrtük. A kapott gélt jéghideg vízzel és 4 ml jéghideg 0,1 mólos bórax oldattar alaposan kimostuk.. Hozzáadtunk a 7d példa szerint kapott 0,106 g 159 000 E/g aktivitású E. coli acilázt, és a keveréket 24 óra hosszat 4 C°-on kevertük. Ezután a keveréket beállítottuk 7,5 pH-ra, és szűrtük. A terméket a szűrőn vízzel alaposan kimosva 0,3 g polimert kaptunk 212 E/g fajlagos aktivitással. c) A 12b kísérletet megismételtük 0,1 g Sephadex" A 50 dietilaminoetilcellulózzal Sephadex 5 G 25 helyett. A hozam 1,25 g nedves polimer volt 435 E/g fajlagos aktivitással. d) A 12b kísérletet megismételtük Sephadex G 25 helyett 0,1 g cellulózporral (gyártja a Macherey, Nagel & Co, jele MN—300). A hozam 0,35 g polimer volt 261 E/g fajlagos aktivitással. 13. példa 6-Aminopenicillánsav előállítása 283 g 42 E/g aktivitású enzimoldathoz hozzáadtuk 20 g benzilpenicillin káliumsójának 317 ml vízzel készült oldatát. A keveréket 37 C°-on inkubáltuk, a pH-értéket 2,5 n nátronlúg időnkénti hozzáadásával 7,8-on tartva. Hat óra elmúltával a reakciókeverék 10,7 g (92%) 6-aminopenicillánsavat tartalmazott. Szűrés után az oldat pH értékét 5 n sósav hozzáadásával 3-ra állítottuk be, majd 1/2 térfogat metilizobutilketonnal extrahálva eltávolítottuk a maradék benzilpenicillint és a 6-ammopenicillánsav képződése közben lehasadt fenilecetsav-oldalláncot. Extrahálás után a vizes oldatot elválasztottuk a metilizobutilketontól. A vizes oldat pH értékét 7,5-re állítottuk be, és térfogatát vákuumban 120 ml-re csökkentettük. A koncentrált oldatot 5 C°-ra hűtöttük, és, leszűrtük. A szűrt oldatot 5 n sósavval 4,3 pH-ra megsavanyítva kivált a kristályos 6-aminopenicillánsav. A kristályokat szűrőre vittük; kevés hideg vízzel, majd száraz acetonnal mostuk, és vákuumban megszárítva 8,84 g 6-aminopenicillánsavat kaptunk. A termék tisztasága 95%-os volt, és az összes hozam a benzilpenicillinre számítva 72%. 14. példa 6-Aminopenicillánsav előállítása A 2c példa szerint kapott, 33,8 E/g aktivitású enzimoldatból 375 g-hoz hozzáadtunk 21 g benzilpenicillint káliumsó alakjában, 325 ml vízben oldva. Az oldatot 37 C°-on inkubáltuk, és a pH értékét időnként 2,5 n nátronlúgot hozzáadva 7,8-on tartottuk. Hat óra elmúltával az oldatot 10 C°-ra hűtöttük, és 2 pH-nál 200 ml metilizobutilketonnal extraháltuk a visszamaradt benzilpenicillin és a 6-aminopenicillánsav képződése közben lehasadt fenilecetsav-oldallánc eltávolítására. Az extrahálás után a vizes oldatot elválasztottuk a metilizobutilketonos oldattól, A vizes oldat pH értékét beállítottuk 7,5-re, és térfogatát vákuumban 110 ml-re csökkentettük. A tömény oldatot 5 C°-ra hűtöttük, és 15 20 25 30 35 10 45 50 55 60 7