161251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejtmentes penicillinaciláz előállítására

3 161251 4 a termékben, és okai lehetnek az ilyen penicillinek alkalmazása során tapasztalt allergen reakcióknak (G. T. Stewart, Amer. Heart J-, 1968, 429). Ezeknek a szennyezéseknek az eltávolítására a 6-aminopenicillánsavat vagy az abból készült penicillineket külön tisztító műveleteknek kell alávetni, például dialízist vagy gélszűrést (771 662 számú kanadai szabadalmi leírás) kell alkalmazni. Eközben a 6-APS vagy a penicillin jelentős része elvész, ami kitűnik abból, hogy benzilpenicillinből csak 12%-ot (1 078 847 számú brit szabadalmi leírás) és fenoximetilpenicillinből 56%-ot (1114 311 számú brit szabadalmi leírás) sikerült nyerni. Mindezek a nehézségek elkerülhetők, ha a jelen találmány értelmében sejtmentes vagy tisztított enzímkészítményt használunk. Ily módon, a találmány értelmében sejtmentes vagy tisztított enzimkészítményt alkalmazva penicillinek 6-helyzetében levő amidkötés felhasítására, jó hatásfokkal és lényegében fehérje jellegű szennyezésektől mentesen állítható elő 6-APS. Az ily módon kapott 6-APS acilálva jó hatásfokkal és további tisztítás nélkül szolgáltat csökkent allergen hatású penicillineket. Az irodalom beszámol számos kísérletről tisztított enzimkészítmények E. coli törzsekből történő előállítására. Bor kar és munkatársai [Hindustan Antibiotics Bull. 4, 48, 152 (1961)] foszfátpufferoldatban szuszpendált sejteket ultrahanghullámokkal kezelt, és így sikerült frakcionált kicsapással és oszlopkromatográfiai úton 25-szörös tisztítást elérnie. Holt és Stewart [Nature 201, 824 (1964)] tisztított enzimkészítményt állított elő szűrt fermentlé liofilizálásával és dializálásával. Szentirmai [Acta Microb. Acad. Sei. Hung. 12, 395 (1966)] az E. coli enzim 40-szeres koncentrálását érte el ammóniumszulfátos kicsapással, kalciumfoszfátgélen való adszorpcióval és DEAE cellulózon végzett kromatografálással ultrahanggal kezelt E. coli sejtek foszfátpufferos kivonatából. Sakaguchinak és Maraonak (26 050/64 számú japán szabadalmi leírás) sikerült E. coliból mérsékelt hozammal tisztított enzimkészítményt nyernie oly módon, hogy a sejteket huzamos ideig borátpufferral extrahálták, vagy ezt a kezelést rövidebb ideig ultrahanghullámos kezeléssel kombinálták. A kivonatból ammóniumszulfátos kicsapással, dialízissel és liofilizálással szilárd alakban, nyerték ki az enzimet. Johnson és Hardcastle (3 297 546 számú amerikai szabadalmi leírás) enzimoldatót kaptak. E. coliból oly módon, hogy a sejttenyészetet egy kétértékű fém sójával, rendszerint kalciumnitráttal, és egy kvaterner ammóniumvegyülettel kezelték, a sejteket szűréssel elkülönítették, majd néhány óra hosszat vízben szuszpendálták, a sejteket szűréssel eltávolították, és a szüredéket aktívszénnel kezelték. Ismeretes továbbá, hogy a baktériumsejtekben levő enzimek kiszabadíthatok a sejtszuszpenzióknak szűk nyíláson nagy nyomáson való kisajtolásával. Duerre és Ribi [Appl. Microbiol. 11, 4tffl (1964)] az E. coliban található más enzimeket tanulmányozva azt találták, hogy az enzimek teljes felszabadítására 1000 att-nál nagyobb nyomásra van szükség. Ilyen nyomás alatt azonban a sejtfalak is felaprózódnak, és a 5 sejtanyag jelentős része szolubilizálódik. Frazer [Nature 167, 33 (1951)] azt találta, hogy E. coli sejtek elroncsolhatók kis méretekben, ha 35—63 att gáznyomás alatt kisajtolják a sejteket egy acélpalackból. 10 Mi azt találtuk, hogy az E. coli sejtekben levő penicillinaciláz üzemi méretekben : extrahálható a mikroorganizmusból vízbe, ha a sejteket vagy azok vízzel vagy víz és szerves oldószerek elegyével készült szuszpenzióját hirtelen felszaba-15 dítjuk legalább 35 att nyomás alól, amely azonban nem éri el a sejtek számbajövő roncsolódásához szükséges nyomást. Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárás penicillinaciláz előállítására E. coli-ból ma-2o gába foglalja egy ilyen enzimet termelő E. coli törzs ismert módon való tenyésztését, a fermentlé eltávolítását, és a sejtanyag gyors kisaj tolását egy keskeny résen legalább 35 att nyomás alkalmazásával, amely azonban nem 25 éri el azt a nyomást, amelyen a sejtek szambajövő mértékben roncsolódnak. 210 att nyomás alatt a sejtek még nem roncsolódnak számbajövően. Ezután a kezelt anyagot vízben elkeverjük, adott esetben szerves oldószer és/vagy 30 egy bázis, például nátriumhidroxid vagy trietilamin, hozzáadásával, az enzim feloldása céljából. A találmány szerinti eljárás egyik megvalósítási alakjában a fermentlé eltávolítását és a 35 sejtanyag kisajtolását egyidejűleg végezzük egy öntisztító centrifugális szeparátorban (hámozó centrifugában) 0 és 50 C°, előnyösen 15 és 40 C° között, az elválasztott sejtanyagot szakaszosan 0,05—1,0 előnyösen 0,10—0,5 sec alatt ki-40 sajtolva egy 0,1—1,5, előnyösen 0,3—0,7 mm széles perifériális résen 35—140, előnyösen 63— 77 att nyomás alatt. Ha kívánatos, a fermentlét vízben kevéssé oldható szerves oldószerrel, például butilaeetáttal, izobutilacetáttal vagy 45 amilacetáttal telítjük a mikroorganizmus elölésére és a szeparátorban végbemenő folyamat elősegítésére. Hasonlóképpen lehetséges a sejtanyagnak vízzel való mosása a szeparátorban." A kisajtolt sejtanyagot 10—50, előnyösen 20— 50 40 C°-on 0,10—5,0 előnyösen 0,25-—3,0, optimálisan 0,25—1,0 óra hosszat hatásos keverővel keverjük az enzim feloldására, és adott esetben közben hozzáadunk 1,0—5,0% vízzel nem elegyedő szerves oldószert, például metilizobutil-55 ketont, butilacetátot, izobutilacetátot, amilacetátot, benzolt, toluolt vagy kloroformot. Az enzimnek a kisajtolt sejtanyagból való extrahálódása megkönnyíthető egy szervetlen bázis, például nátriumhidroxid, káliumbidroxid vagy 60 ammónia, vagy egy tercier szerves bázis, például trietilamin vagy N-etilpiperidin, hozzáadásával és így a keverék pH értékének 6,5 és 9,0, előnyösen 7,0 és 8,5 közé való beállításával. Az így kapott enzimoldat, esetleg vízzel való 65 hígítás után, ismert módon, például szűréssel 2