161251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejtmentes penicillinaciláz előállítására

5 161251 6 vagy centrifugálással vagy e két művelet összekapcsolásával, és esetleg szíátelenítő, derítő és szűrést elősegítő anyagok, például aktívszén, alumíniumoxid, cellulózpor, kovaföld vagy más gyengén adszorbeáló anyagok hozzáadásával megszabadítható az esetleg visszamaradt sejtanyagtól és más szilárd szennyezésektől. Előnyös módszer a sejtanyag zömének eltávolítása centrifugálással és a kapott folyadék szűrése. Az enzim tovább tisztítható a vizes oldat 3,0— 6,0, előnyösen 4,0—5,0 pH értékre való megsavanyításával, a csapadék kiszűrésével és az eredeti pH érték helyreállításával. A penicillinaciláz az így kapott sejtmentes és adott esetben részben tisztított vizes oldatokból fehérjékkel mérsékelten oldható komplexeket alkotó anyagokkal, például csersavakkal kiválasztható. A találmány szerinti eljárás egyik módosulata szerint az enzimoldatot 4—6, előnyösen 4,5—5,5 pH-nál 300—900 mg/kg végső koncentrációig vasionokkal komplexet alkotó kelátképző vegyületek, például etiléndiamintetraecetsav jelenlétében csersavval kezeljük. A képződött enzim-csersavkomplex szokásos módon, például szűréssel vagy centrifugálással elkülöníthető. Ezután kívánság esetén mossuk, szárítjuk, a vizet, például szárítással, nevezetesen liófilizálással, vagy vízzel elegyedő szerves oldószerekkel, például acetonnal történő kezeléssel eltávolítjuk. A csersavas komplex alkalmas az enzim tarolására és szárítására. Felhasználható közvetlenül is penicillinek, például benzilpenicillin oldalláncának eltávolítására. A csersavas csapadék penicillinaciláz-tartalma felszabadítható vizes oldatba a komplexnek 7—9, előnyösen 7,5—8,5 pH-nál vízben való oldásával. "Úgy is eljárhatunk, hogy a komplexet víznek és vízzel nem elegyedő oldószernek, például n-butanolnak a keverékével 4—7, előnyösen 4,5—5,5 pH-nál kezeljük. A csersav eltávolításának további módja abban áll, hogy a vízben szuszpendált enzim-csersavkomplexet anioncserélővel, például DEAE-cellulózzal kezeljük, ez megköti a csersavat, és az enzim a vízbe kerül. Az ezekhez a műveletekhez szükséges víz mennyisége sokkal kisebb, mint az eredeti enzimoldatok víztartalma, úgyhogy ilyen módon az enzim hatásosságának lényeges fokozódása érhető el. A találmány szerinti eljárás keretében a kapott oldatok penicillinaciláz-tartalma ioncserélővel növelhető és tisztítható. Eszerint az enzimet 3,5—6,0, előnyösen 4,0—5,0 pH értékre beállított oldatának SE-Sephadex, karboximetilcellulóz vagy CM-Sephadex kationos ioncserélővel töltött oszlopon való átbocsátásával adszorbeáltatjuk, vagy az ioncserélőt keverés közben az enzimoldathoz adjuk. Az aciláz az ioncserélőről felszabadítható egy 6,0—8,0 pH értékű pufferoldattal, például 0,2 mólos ammóniumaeetáttal vagy trisz-hidroximetilammóniumacetáttal való eluálással. Tisztább enzimkészítmények előállítására a szervetlen ionok és kis molekulasúlyú szennyezések az enzimoldatokból vízzel szemben való dializálással távolíthatók el. Ugyanez érhető el az oldatnak, szükség esetén 50 G° alatti hőmérsékleten 25—100 mg/ml koncentrációig valóbepárlása után végzett gélszűrésével. Az előzőkben ismertetett műveletek bármelyikével kapott vizes oldatok igen alkalmasak közvetlenül természetes penicillinek oldalláncainak, különösen pedig benzilpenicillin oldalláncának eltávolítására. Az ismertetett műveletekkel kapott enzim kinyerhető a vizes oldatból szilárd állapotban liófilizálással, porlasztásos szárítással, vákuumban való bepárlással vagy kiesapással ismert módszerek szerint. Az elkülönített szilárd enzimnek nagy a fajlagos aktivitása, és nagyon alkalmas tárolásra és szállításra. Az ilyen szilárd, vízben oldható enzimkészítményeknek számos technikai előnye is van, mert lehetővé teszik, hogy. töményebb oldatokkal dolgozzunk, mint amelyeket a sejtszuszpenziókat alkalmazó ismert eljárásokban használnak. Az enzim elkülönítésének előnyös módja az enzimoldat liofilizálása —10 és 50, előnyösen 0 és 30 C° között vagy lebegtetéses szárítás levegőáramban 10—55, előnyösen 35—45 C°-on. A találmány szerinti eljárással készült tisztított enzimek és enzimoldatok nagyon alkalmasak és előnyösek 6-aminopenicillánsav előállítására penicillinek, különösen benzilpenicillin oldalláncának eltávolításával. A termékek hozama és tisztasága lényegesen nagyobb, mint ami eddig ismert eljárásokkal, E. coli sejtek szuszpenziójának alkalmazásával elérhető volt. Azt találtuk továbbá, hogy a találmány szerint készült 6-aminopenicillánsav nagyon kevés olyan allergen hatású fehérje jellegű szennyezést tartalmaz, amelyek az E. Coli sejtek szuszpenziójával készült 6—APS készítményeket szennyezik. Ennek nagy a műszaki jelentősége, mert így lehetővé válik csökkent allergen hatású penicillinek előállítása a találmány szerinti eljárással készült 6—APS-ből közvetlenül, további tisztító műveletek nélkül. Az ily módon előállítható csökkent allergen hatású penicillinek például az a-fenoxietilpenicillin, a-fenoxipropilpenicillin, 2,6-dimetoxifenilpenicillin, 3-(o-klórfenil)-5--metil-4-izoxazolilpenicillin, a-karbonilbenzilpenicillin, ct-azidobenzilpenicillin és ct-aminobenzilpenicillin. Az E. coli penicillinaciláz enzimje felhasználható penicillinészterek, különösen a benzilpenicillin észterei oldalláncának eltávolítására. Azt találtuk, hogy a találmány szerinti eljárással kapott enzimkészítmények igen alkalmasak erre a célra, és hatásosabbak, mint az eddig használt E. coli sejtszuszpenziók. Megállapítottuk azt is, hogy a találmány szerinti enzimkészítmények előnyösebben használhatók a korábban használt sejtszuszpenzióknál penicillineknek 6—APS-ből és oldalláncos kiindulási anyagokból való enzimes szintézisére (W. K. Kaufmann és munkatársai: Antimicrobial Agents Ann. 2960, 1). ' 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3