161215. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a pregnán- és androsztán-sor 11 alfa-hidroxi-3-oxo-delta1,3-szteroidjainak előállítására kevert fermentációval
5 6,5 közötti pH-értéken végezzük. A pH-érték jobb stabilizálása céljából előnyösen a táptalajhoz káliumdihidrogénfoszfátot adagolunk pufferként. A tenyészetet előnyösen kb. 25—30 °C között tartjuk. A dehidráláshoz ismét egy meg- 5 határozott pH-értéket, előnyösen 7 pH-értéket állítunk be és a hőmérsékletet kb. 30 °C-on tartjuk. 1. példa 10 . 250 literes acélfermentorban 117,5 liter alábbi összetételű folyékony táptalajt sterilezünk: 1,000% kukoricalekvár 1,000% szójaliszt 15 0,005% szójaolaj 0,750% KH2 P0 4 q. s. csapvíz 6,2 pH-értékre beállítva. 20 A sterilezett közeget 7,5 liter, 18 óra hosszat előfermentorban tenyésztett Aspergillus ochraceus kultúrával beoltjuk, és 29 °C-on 128 fordulatszám/perc keverési sebesség mellett 20 m3 steril levegő/óra bevezetésével fermentáljuk. A 25 szubsztrátum 126 g 6et-fluor-21-acetoxi-16a-metil-4-pregnén-3,20-dion 1,25 liter dimetilszulfoxidban feloldott és sterilen szűrt oldata, amelyet a beoltást követő 10 óra után adagolunk. A szubsztrátum beadagolásával egyidejűleg 30 6,2—6,5 közötti pH-értéket állítjuk be, a pH-értéket 4 órás időközökben utánaállítjuk és a teljes első reakciólépésben a megadott pH-tartományban tartjuk. A mikrobiológiai átalakulás végbemenetelét 35 oly módon ellenőrizzük, hogy 1 órás időközökben a fermentorből mintát veszünk, a mintát metilizobutilketonnal extraháljuk és a kivonatot vékonyréteg-kromatográfiával analizáljuk. (Kovasavgél-készlemezek; Merck cég, 5+4+1 40 benzol-etilacetát-jégecet rendszer.) 23 óra érintkezési idő után a szubsztrátum nyomokban kimutatható mennyiségig 6a-fluor-lla,21-dihidroxi-16a-metil-4-pregnén-3,20-dionná alakul át. Az első fermentációs időszakban egy második 45 fermentációs edényben 124 liter alábbi összetételű folyékony táptalajt sterilezünk: 0,2% élesztőkivonat 1,0% kukoricalekvár 0,1% cukrosított keményítő 50 q. s. csapvíz 7,0 pH-értékre beállítva. A táptalajt 24 óra hosszat rázólombikban szaporított 1 liter Bacillus lentus tenyészettel beoltjuk. 10 órás szaporítási idő után a télies bak- 55 tériumtenyészetet abba a szubsztrát-fermentorba visszük át, amelybe a lla-helyzetben történő hidroxilezést 23 órás érintkezési idő után befejeztük, majd a tenyésztést folytatjuk. A szubsztrátum-f ermentor pH-értékét a baktérium- 60 tenyészettel történő beoltás előtt 7.0-ra állítjuk be, további pH-áülítás már szükségtelen. A dehidrálást is vékonyréteg-kromatográfiai elemzéssel követjük (a Merck eé<* kow-avgél-készlemezei, amelyet a mintaoldat felhor- 65 6 dása előtt kénsav-etanol keverékkel bepermetezünk és ismét aktiválunk, 96+4 kloroform-metanol rendszer). A Bacillus lentus tenyészet hozzáadása után 8 órával a dehidrogénezés befejeződik. Végül a micéliummasszát leszűrjük és a szűrletet háromlépcsős Luwesta-extraktorban 2:1 arányban metilizobutilketonnal extrahaljuk. A metilizobutilketonos kivonatot forgóbepárlóban vákuumban 500 ml térfogatra bepároljuk, majd a * koncentrátumot éjjelen át hűtőszekrényben állni hagyjuk. A kivált kristályokat leszívatjuk, kevés hideg metilizobutilketonnal mossuk, vákuumban megszárítjuk, végül elemzésnek vetjük alá. A termék tiszta 6a-fluor-llct,21-dihidroxi-16a-metil-l,4-pregnadién-3,20-dion tartalma 95,4%. Az anyagveszteségek levonása után — amelyek a mintavételéből erednek — a reakcióhozam mindkét lépésben 71%-os elméletinek felel meg. Az elméletileg lehetséges további 15,5% végterméket a kristályosítási anyalúgból oszlopkromatográfiás úton nyerhetjük ki, 2,3%-ot pedig a leszűrt micélium extrakciójávai izolálhatunk. Az egylépcsős eljárás összhozama 88,8% az 'elméletire számítva. 2. példa Az 1. példa szerinti reakciófeltételek mellett 17,21-dihidroxi-16a-metil-4-pregnén-3,20-diont Aspergillus ochraceus/Bacillus lentus MB 284 segítségével inkubálunk. 65 órás összérintkezési idő után a fermentációs terméket feldolgozzuk. A nyersterméket etilacetát-metanol elegyből átkristályosítjuk, amikor lla,17,21-trihidroxi-16a-metil-l ,4-pregnadién-3,20-dionhoz jutunk. (Hozam: az elméleti 79%-a.) 3. példa Az 1. példa szerinti reakciófeltételek mellett 17.21 -dihidroxi-4-pregnén-3,20-diont Aspergillus ochraceus/Bacillus lentus MB 284 segítségével inkubálunk, majd 52 órás összérintkezési idő után a fermentált terméket feldolgozzuk. A nyersterméket kovasavgél oszlopon kromatográfiás úton tisztítjuk, így lla,17,21-trihidroxi-l,4--pregnadién-3,20-dionhoz jutunk. A hozam az elméleti 60%-a. 4. példa Az 1. példa szerinti reakciófeltételek mellett 17a-hidroxi-progeszteront Aspergillus ochrace^ us/Bacillus lentus MB 284 segítségével inkubár lünk és 61 órás összérintkezési idő után a fermentált terméket feldolgozzuk. A nyersterméket kovasavgél oszlopon kromatográfiás úton tisztítjuk; a kapott lla,17-dihidroxi-l,4-pregnadién-3,20-dion olvadáspontja 254/259—261 °C. Hozam: az elméleti 67%-a. 3
