161093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin C komplex és paromomicin előállítására

161093 7 8 elő. A szén- és nitrogénforrások, szervetlen sók, valamint egyéb járulékos alkatrészek felhasználása többféle táptalaj összeállítást is lehetővé tesz. A szén- és nitrogénforrásokat önmagukban vagy keverékek alakjában is alkalmazhatjuk. A rázott kultúra, az inokulum fermentáció, illetve a termelő fermentáció táptalajigénye némiképpen eltérő, bár a fő alkatrészek minősége mindhárom esetben azonos. A maximális antibiotikum termelés keményítővel mint szénforrással érhető el. Ebben az esetben a legelőnyösebben használható nitrogénforrásnak a szójaliszt és kukoricalekvár bizonyult. A- táptalaj alkatrészeket csapvízben oldva, illetve szuszpendálva együttesen sterilezzük 121 C°-on 1 órán keresztül. A legjobb termelést biztosító táptalaj igen sűrű, különösen a fermentáció elején. Az organizmus igen levegőigényes, ezért jó növekedést csak megfelelő keverőberendezéssel ellátott, intenzív levegőzést biztosító fermentorban kaphatunk. A tenyészet pH-ja a sterilezés utáni 7,2 értékről a növekedés folyamán 40 órás tenyészetben 6,3-ra esik, majd újra lassan emelkedik, 130 óra alatt 6,8—7,0 körüli értékre. Az antibiotikum termelés a 30. óra körül indul meg és 80—120 óra között éri el a maximális értéket. A tenyésztésre és antibiotikum termelésre legalkalmasabb a folyékony táptalajban, süllyesztett kultúrában végzett fermentáció. A fermentáció hőfoka 22—40 C° között változhat, de legcélszerűbb a tenyésztést 28 C°-on végezni. A keverő fordulatszáma előnyösen 250°perc, a levegőztetés 1/1 v/v percenként. Minthogy a fermentáció ideje, a maximális antibiotikum koncentráció és a megfelelő antibiotikum arány elérése még azonos táptalaj öszszetétel és fermentációs körülmények ellenére is igen eltérő lehet, célszerű a táptalaj összes antibiotikum tartalmát biológiai vizsgáló módszerrel, Bacillus subtilis 6633 teszt-organizmus felhasználásával ellenőrizni, A termelt hatóanyag kvalitatív és kv-antitatív összetételét 100 ml-es mintákból végzett ioncserélős elkülönítés után az irodalomban leírt papírkromatográfiás módszerrel határoztuk meg (J. Chromatogr. 30, 572. [1967]). Az erjesztéses oldatból a termelt antibiotikumokat az aminociklitól-aminoglikozid antibiotikumok elkülönítésénél általánosan szokásos módszerekkel vonjuk ki. Minthogy az S—244 jelzésű törzs gentamicint és a hozzá fizikai és kémiai tulajdonságokban hasonló jellegű paromomicint termel, az elkülönítés első lépése után ezen antibiotikumok elegyét kapjuk, melyből azután különféle ioncserélő módszerek felhasználásával állíthatjuk elő a tiszta antibiotikumokat. Az elkülönítés egy előnyös módja az alábbi lépésekből áll: Az erjesztéses oldat pH-ját célszerűen oxálsawal 2,0—4,0 értékre állítjuk, majd leszűrjük. A szűrletet ammóniumhidroxiddal gyengén alkalikus pH-ra, célszerűen 8,0-ra állítjuk be, majd az antibiotikumot karboxil típusú kationcserélő gyantán, célszerűen Wofatit CP—300 vagy Amberlite CG—50—I. gyantán ammónium formában megkötjük és ezután a hatóanyago-5 kat 0,5—1,5 n ammóniumhidroxiddal leoldjuk. Az eluátumot vákuumban kb. 30% szárazanyagtartalomig bepároljuk, és az így kapott vizes oldatot, melynek pH-ja kb. 9,5 szükség esetén újra megkötjük ammónium formájú karboxil tí-10 pusú kationcserélő gyantán. Ezzel a lépéssel a hatóanyagok további koncentrálásán túl a kísérő szennyező anyagok jelentős mennyiségét is eltávolíthatjuk, minthogy ezek ilyen körülmények között az ioncserélő gyantán megkötődés 15 nélkül keresztülfolynak. A gyantaágyat ezután 0,05—0,08 n ammóniumhidroxiddal mosva a visszamaradó abszorbeált színezőanyagokat és egyéb szerves és szervetlen szennyezéseket eltávolítjuk, majd a gyantaágyat 0,15—0,25 n, cél-20 szerűen 0,2 n ammóniumhidroxiddal eluálva elsősorban a paromomicint, ezután 0,3—0,6 n, célszerűen 0,5 n ammóniumhidroxiddal a gyantaágyon maradó gentamicint oldjuk le. Ez az eljárás egyes esetekben nem eredményez 25 még tökéletes elválasztást, ezért további tisztítási lépésekre is szükség lehet. A továbbiakban a kapott két eluátum frakciót külön-külön kezelve a 0,2 n eluátomból paromomicint, a 0,5 n eluátumból pedig gentamicint és esetleg paro-30 momicint állítunk elő. A további elválasztás szükség esetén egy erősen bázisos, kis porozitásfokú polistirol-vázas, 2—4% divinilbenzollal kopolimerizált anioncserélő gyantán, célszerűen Dowex—1X2 gyanta segítségével érhető el oly 35 módon, hogy az egyes eluátum frakciókat 30% szárazanyagtartalomig bepárolva a hidroxidformájú gyantaágyra visszük, majd a gyantaágyat ionmentes desztillált vízzel eluálva úgynevezett ion-kizárásos kromatográfiai végzünk. Ebben az 40 esetben a gentamicin igen hamar leoldódik, illetve a gyantán meg sem kötődik, míg a paromomicin csak a későbbi frakciókban eluálódik. Ily módon megfelelően méretezett gyantaágy és leoldási sebesség esetén teljesen tiszta gentami-45 cin, illetve paromomicin állítható elő. Az antibiotikumok végső tisztítására, illetve elválasztására szükség esetén valamely igen finom szemcsés karboxil típusú kationcserélő gyantaoszlopon 0,05—1,0 n ammóniumhidroxiddal végzett 50 gradiens eluciós kromatográfia is alkalmas. A fenti módszerek igen nagy előnye, hogy az ammónium formájú gyanta felhasználása és a vizes, illetve az ammóniás eluálás következtében 55 az eluátumok bepárlásakor gyakorlatilag hamumentes termékek keletkeznek. Természetesen az ismertetett elkülönítési, illetve tisztítási lépéseket szükség szerint kombinálva, illetve egyes lépéseket elhagyva is lehet alkalmazni. 60 A végső tisztítási lépések után az egyes antibiotikumokat tartalmazó frakciókat vákuumban szárazra párolva, vagy liofilizálva, megfelelő tisztaságban szabad bázis formájában kapjuk meg az egyes antibiotikumokat. An antibiotiku-65 mok szabad bázisait ismert módszerekkel, pl. 4