161093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin C komplex és paromomicin előállítására
9 161093 10 számított mennyiségű vizes kénsavban oldva szulfát sóvá alakítjuk és fiofilizáljuk vagy metanollal vagy acetonnái lecsapjuk a szulfátot és így a forgalomban levő termékekkel teljesen azonos tulajdonságú gentamicin-szulfátot, ill. paromomicin-szulfátot kapunk. Ezen termékek tulajdonságai mindenben megegyeznek az irodalomban leírt adatokkal és közvetlen kromatográfiás összehasonlításuk is bizonyította az egyes antibiotikumok, ill. sóik azonosságát. Egyes esetekben, amikor a gentamicin termelés magasabb szintet ér el, az elkülönítési folyamat lényegesen leegyszerűsíthető. Elegendő pl. valamely finomszemcsés karboxil-típusú kationcserélő gyantaoszlopon, célszerűen Amberlite— CG—50—I (NH) típusú gyantán végzett ammonias gradiens eluciós kromatográfiai követő Dowex—1X2 (OH) oszlopon történő finomtisztítás. Az antibiotikumok kinyerésére természetesen alkalmazhatunk bármely más ismert, a gentamicin, ill. paromomiein elkülönítésénél leírt eljárást is, mint pl. az aktívszenes adszorpciós folyamatot vagy szelektív leesapószeres eljárást. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa A steril burgonya-glükóz ferdeagar tenyészeten fenntartott Streptomyces longisporoflavus S—244 jelzésű törzs kultúráról 5 ml desztillált víz segítségével kapott spóraszuszpenzió 1 miével (spóraszám: 106 /ml) 100 ml steril folyékony táptalajt oltunk be. A táptalaj összetétele a következő : I. Glükóz Szójaliszt Kazeinhidrolizátum NaCl CaC03 20 g/liter 20 g/liter 5 g/liter 3 g/liter 4 g/liter A tenyészetet rázógépen (320 fordulat/perc, 3,6 cm kilengés) 28 C°-on 48 órán át inkubáljuk. Az így kapott sűrű tenyészet 500 ml-ével (5 db párhuzamos rázott tenyészet) 100 liter steril táptalajt oltunk be. A táptalaj összetétele a következő: II. Keményítő Szójaliszt Kukoricalekvár Ammóniumszulfát Káliumnitrát Kalciumkarbonát Napraforgóolaj 20 g/liter 1 g/liter 2 g/liter 4 g/liter 1 g/liter 5 g/liter 1 g/liter Az inokulum tenyésztését keverés és levegőztetés mellett steril körülmények között 45—55 órán át folytatjuk. A tenyésztés hőfoka 28 C°, a keverés 250 fordulat/perc, a levegőztetés 1/1 v/v percenként. A beérett inokulum halvány zsemlyeszínű, finoman szemcsés. Ezt az inokulumot használjuk fel a termelő fermentáció táptalajának oltásához. A termelő fermentáció táptalajának összetétele a következő: 10 III. Keményítő Szójaliszt Kukoricalekvár Ammóniumszulfát Káliumnitrát Kalciumkarbonát Napraforgóolaj 30 40 45 50 55 60 65 60 g/liter 4 g/liter 4 g/liter 5 g/liter 3 g/liter 5 g/liter 1 g/liter Az oltáshoz használható inokulum mennyiséin ge 5—15 tf%. A táptalajt keverés közben 121 C9 -on 1,3—1,4 atü nyomáson 1 órán át sterilezzük. A táptalajt 28 C°-ra hűtjük, majd 1000 liter táptalajt 80 liter inokulummal oltunk be. A tenyésztést saválló acélfermentorban steril levegő 20 átfúvatásával állandó keverés közben 28 C°-on végezzük. A keverő fordulatszáma 250/perc, a levegőztetés 1/1 v/v percenként. Az antibiotikumok termelése már a fermentáció 30. órájában megindul és a'maximális értéket 90—100 óra kö-25 zött éri el. 1000 liter erjesztéses oldathoz (amelynek koncentrációja megfelel 980 mcg/ml paromomicinnek, ill. 48 mcg/ml gentamicinnek) annyi szilárd oxálsavat adunk állandó keverés és hűtés közben (kb. 10 kg), hogy az elegy pH-ja 3,0 + 0,25 legyen, majd az elegyet szűrőprésen megszűrjük. 100 liter vízzel végzett mosás után 975 liter halványbarnássárga oldatot kapunk. Az oldat pH-35 ját 25%-os ammóniumhidroxiddal 8,0 + 0,2-re állítjuk be, majd szükség esetén az elegyet újra megszűrjük. Az így kapott oldatot 10 liter ammóniumformájú Wofatit CP—300 gyantát tartalmazó oszlop (átmérő: 16 cm, gyantaágy magassága: 50 cm) folyatjuk át 50 liter/óra sebességgel. Az átfolyt fermentlé hatóanyagtartalma kisebb mint 5 mcg/ml. A gyantaágyat ezután 50 liter desztillált vízzel, majd 50 liter 0,05 n ammóniumhidroxiddal 20 liter/óra sebességgel átmossuk. A gyantaágyon megkötött antibiotikumokat ezután 50 liter 1,5 n ammóniumhidroxiddal oldjuk le. A leoldás sebessége 5 liter/óra. A kapott 50 liter eluátum hatóanyagtartalma 18500 mcg/ml. Az eluátumot vákuumban maximum 80 C°-on 2,5 liter térfogatra pároljuk be. A sötétbarna, esetleg feketés színű sűrítményt, melynek pH-ja kb. 8,5—9,0, 5 liter ammónium formájú Wofatit CP—300 gyantát tartalmazó oszlopon (átmérő: 10 cm, gyantaágy magassága: 63 cm) kötjük meg 0,5 liter/óra sebességgel. Az átfolyt oldat maximálisan 500 mcg/ml hatóanyagot tartalmaz. A gyantaágyat ezután 10 liter 0,05 n ammóniumhidroxiddal mossuk át, majd az antibiotikumokat először 5 liter 0,2 n, majd 5 liter 0,5 n ammóniumhidroxiddal oldjuk le 0,2 liter/óra sebességgel. A kapott két eluátum hatóanyagtartalmát kvantitatív papírkromatográfiás módszerrel meghatározva azt találtuk, hogy a paromomiein az első, a gentamicin pedig a második eluátumban dúsul fel. „•5
