161093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin C komplex és paromomicin előállítására

5 161093 6 azért meglepő, mert mind ez ideig valamennyi gentamicint vagy gentamicin jellegű antibiotikumot termelő törzs a Micromonosporaceae család fajai közül került ki. Mostanáig egyetlen olyan sugárgomba törzs sem volt ismeretes, amely a paromomicin mellett gentamicint is termelne. Vizsgálataink során olyan módszert dolgoztunk ki, amely elsősorban a termelési körűimé^ nyék változtatásával lehetővé teszi az S—244 jelzésű törzs által termelt antibiotikumok arányának a gentamicin termelés felé történő eltolódását. Ezáltal elérhető, hogy két gyógyászatilag jelentős antibiotikumot egyetlen törzs, a Streptomyces longisporoflavus fermentálásával egyidejűleg gazdaságos módon állítsunk elő. Az S—244 jelzésű törzs által termelt paromomicin mennyisége 600—1200 mcg/ml, ezzel egyidejűleg a gentamicin termelési szintje 50—100 mcg/ml-t ér el. Eljárásunk nagy előnye, hogy e viszonylag magas termelési értékek mellett az antibiotikumok kinyerésének hozamai is igen magasak; a paromomicinre vonatkoztatva 40—50%, a gentamicinre vonatkoztatva pedig 40—55% körüli értékeket kapunk. A paromomicin termelési szintje a 40 135 sz. NDK-beli szabadalmi leírás szerint pl. 260—600 mcg/ml és a kísérleti példák alapján a paromomicin elkülönítését 19, illetve 20%-os hozammal oldják meg. A gentamicin termelési szintje a 3 091 572 sz. amerikai szabadalmi leírás szerint pl. 15—25 mcg/ml, és a feldolgozás hozama a nyers gentamicinre vonatkoztatva, a 3. példa tanúsága szerint kb. 33%. A gentamicinnek a szabadalom szerinti előállításánál a kísérő antibiotikumok (gentamicin A és B, BA—3A, BA—3B) elválasztása érdekében bonyolult lecsapási eljárásokat kell az ioncserélős elválasztási és tisztítási lépések közé iktatni, mely az eljárást igen nehézkessé teszi. Az S—244 jelzésű törzs neomicin termelése gyakorlati szempontból elhanyagolható, mivel az egyes fermentációk során kimutatható neomicin mennyisége igen csekély (az összes antibiotikumoknak 0,1%-a, ami maximálisan 1 mcg/ml-nek felel meg), és az elkülönítési műveletek során a fő antibiotikumoktól jól elválasztható, így semmiféle további zavart nem okoz. Eljárásunk további előnye a magas termelési szinten és a jó elkülönítési hozamokon túlmenőleg az a tény, hogy a két gyógyászatilag is igen jelentős antibiotikumot egyetlen fermentációval állítjuk elő, és így az: előállítási költségek (táptalaj, energia felhasználás, munkaidő ráfordítás, általános üzemköltségek stb.) lényegesen csökkennek, és a fermentor-^kihasználás is kétszeresére növekszik. Az antibiotikumok elkülönítése, illetve elválasztása ezzel szemben egyáltalán nem válik bonyolultabbá. Az általában amúgy is szükséges tisztítási lépésekhez hasonló elválasztási műveleteknél az egyes antibiotikumokat tartalmazó frakciókat kell csupán a továbbiakban külön-külön kezelni. A nagyüzemileg is igen kényelmetlenül keresztülvihető ioncserélős lépésekből álló elkülönítési és elválasztási eljárásunk során különösen előnyös az, hogy nincs szükség az egyes lépéseknél a szilárd közbenső termékek elkülönítésére, ami tovább növeli eljárásunk gazdaságosságát. A találmány szerint úgy állítunk elő gentamicint és paromomicint, hogy a Streptomyces longisporoflavus S—244 jelzésű törzset komplex fehérjét, szénhidrátot és ásványi sókat tartalmazó táptalajon aerob körülmények között tenyésztjük, majd a tenyészetből a felhalmozódott antibiotikumokat fizikai és kémiai módszerekkel kivonjuk, majd a kapott antibiotikum elegyet ismert módszerekkel, elsősorban ioncserélő módszerekkel elválasztjuk. A fent leírt törzset 1971. március 11-én 64/1971 szám alatt az Országos Közegészségügyi Intézetnél letétbe helyeztük. A Streptomyces longisporoflavus S—244 jelzésű törzs tenyésztésére a sugárgombák tenyésztésénél általánosan szokásos módszerek alkalmazhatók. A tenyésztést legelőnyösebben sülylyesztett kultúrában végezhetjük. A tenyésztésre szolgáló táptalajban vízben oldott, illetve szuszpendált, a gomba által asszimilálni képes szenes nitrogénforrások, szervetlen sók és egyéb járulékos alkatrészek (bioszanyagok, habzásgátlók stb.) lehetnek jelen. Szénforrásként keményítőt, glükózt, fruktózt, mannózt, mannitot, glicerint és raffinózt alkalmazhatunk. Legelőnyösebb szénforrásnak a keményítő bizonyult. Nitrogénforrásként célszerűen természetes eredetű anyagokat, szójalisztet, kukoricalekvárt, mogyorólisztet, zablisztet, hallisztet, kukoricalisztet vagy természetes eredetű aminosav elegyeket, mint kazeinhidrolizátumot, peptont, vagy mesterséges aminosav elegyeket és szervetlen nitrogénforrásként is szereplő ásványi sókat, mint káliumnitrátot, ammóniumszulfátot vagy ammóniumkloridot alkalmazunk. A legelőnyösebb nitrogénforrásnak a szójaliszt és a kukoricalekvár bizonyult. Szervetlen sóként a káliumnitrát és az ammónium sók mellett elsősorban a táptalaj pufferkapacitásának biztosítására nátriumkloridot, magnéziumszulfátot és kálciumkarbonátot alkalmazunk. A táptalaj foszfát sókat általában nem tartalmaz, minthogy a foszfát ionok 0,50%-nál nagyobb koncentrációban már gátolják az antibiotikum termelést. Járulékos alkatrészként élesztőkivonatot, húskivonatot, esetleg különféle vitaminokat alkalmazhatunk. A kobalt ionok mennyiségének növelése nem fokozza az antibiotikumok termelését, sőt 2 mcg/ml koncentráció felett már az antibiotikum termelés csökkenéséhez vezet. Habgátlóként általában növényi olajokat, pálmaolajat vagy napraforgóolajat használhatunk. Igen fontos, hogy a táptalajban a szén- és nitrogénforrások, valamint a szerves és szervetlen alkotórészek megfelelő arányban forduljanak 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3