161004. lajstromszámú szabadalom • Eljárás PGF1 -típusú prosztaglandin-analógok előállítására

47 161004 48 hidrogénperoxidot adagolunk be, mimellett a hőmérsékletet 10° alatt tartjuk. Az elegyet ezután 35 percig szobahőmérsékleten keverjük és a rétegeket elválasztjuk. Á vizes fázist kétszer éterrel és háromszor etilacetáttal extraháljuk. A szerves oldatokat egyesijük és telített vizes nátriumklorid-oldattal mossuk, majd magnéziumszulfát felett szárítjuk, szűrjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. így 89 g maradékot kapunk, amely 6-karbetoxi-biciklo[3.1.0]hexán-3-ol és 6-karbetoxi-biciklo[3.1.0}hexán-2--ol elegyéből áll, és főleg a 3-olt tartalmazza. 19. példa: 6-Karbetoxi4)i'CÍklol[3.1.0]hexán-3-ol tetrahidropiranil-éter és 6-karbetoxi-biciklo[3.1.0]hexán-2-ol tetrapiranil-éter. 88,0 g 6-karbetoxi-biciklo[3.1.0]hexán-3-olból és 6-karbetoxi-biciklo[3.1.0]hexán-2-olból álló elegyet és 88 ml dihidropiránt Ö°-ra hűtünk és 40 csepp foszforoxikloridot adunk hozzá. Az elegyet 0°-on 2 óra hosszat, majd szobahőmérsékleten 18 órán át keverjük. Az elegyet ezután metilónkloriddal hígítjuk és telített vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattal mossuk. A rétegeket elválasztjuk és a vizes fázist három ízben metilénkloriddal extraháljuk. A szerves fázisokat egyesítjük és vízzel mossuk (a mosóvizeket visszaextraháljuk), nátriumszulfát felett szárítjuk és csökkentett nyomáson bepároljuk, amikoris maradékot kapunk. Ezt csökkentett nyomáson desztilláljuk; előbb 18 g előpárlatot kapunk amely 40°-on forr 1,3—0,4 Hg mm nyomáson, ezután 75,3 g 6-karbetoxi-bicikla[3.1.0j'hexán-3-ol tetrahidropiranil^éter és 6-karbetoxi-biciklo [3.1.0] hexán-2-ol tetrahidropiraniléter elegyet kapunk, 98—131° (0,3—1,0 Hg mm) forrásponttartományön belül. 20. példa: PGE!, PGEi-metílészterből. A. Enzim-készítés. Táptalajt készítünk, amely 2% kukoricalekvárt (cerelóz és glükóz egyenlő részarányú keveréke) tartalmaz csapvízben., Ezt sósav hozzáadásával 4,5 pH-ra megsavanyítjuk és 1% metiloleátot adunk hozzá. Négy darab 500 ml-es lombikban a fenti táptalajból 100—100 ml-t helyezünk el és beoltjuk Cladosporum resinae (C 1—11, ATCC 11.274)-vel, majd szobahőmérsékleten (kb. 28°) 4 napig rázatjuk. A tenyészetet ezután 40 ml-es centrifuga-csövekbe helyezzük és klinikai centrifugában kb. 2000 ford/ /perc sebességgel centrifugáljuk. A centrifugacsövekből származó folyadékot dekantáljuk és az összegyűjtött sejteket hideg vízzel mossuk. Két eentrifugáló-csőből a mosott sejteket felszuszpendáljuk 50 ml jéghideg 0,05 mólos 7,0 10 15 20 30 35 55 60 65 pH-jú foszfátpufferben és elhelyezzük egy jéggel hűtött kisméretű Waring keverőben. Üveggyöngyöket adunk hozzá és a szuszpendált sejteket 15 percig keverjük a keverőben. A kapott, zúzott sejteket tartalmazó szuszpenziót klinikai centrifugában szobahőmérsékleten 15 percig kb. 2000 ford./perc sebességgel centrifugáljuk, majd a szupernatáns folyadékot összegyűjtjük. Ez a szupernatáns folyadék Cladosporium resinae acilázt tartalmaz, és azt közvetlenül felhasználhatjuk PGEi-alkilészterek hidrolizálására, vagy előnyösen fagyasztva tárolhatjuk, ameddig az szükséges. B. A PGEi-metilészter észteráz-hidrolízise. A példa A. pontjában leírt módszerrel előállított Cladosporium resinae acilázt tartalmazó szupernatáns folyadékból 10 ml-t és 50 mg PGEi-metilésztert szobahőmérsékleten nitrogén alatt rázatunk kb. 19 óra hosszat, majd 70 ml acetont adunk hozzá és az elegyet szűrjük; így szűrletet és oldhatatlan maradékot kapunk. Vé-25 konyréteg-kromatográfiás analízis (szilikagél lemezen, előhívás kloroform-ecetsav-metanol 90 : : 5 : 5 : eleggyel) azt mutatja, hogy úgy a szűrlet, mint a szűréssel kapott oldhatatlan maradék PGEi-et tartalmaz. A szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk, és így 40—50 mg kissé sárga olajat kapunk, ami PGEi—bői áll. Ezt az olajat és az oldhatatlan maradékot egyesítjük és 10 g savval mosott szilikagélen (Silic ARCC—4, Mallinckrodt) kromatografáljuk. Az eluálást növekvő mennyiségben etilacetátot tartalmazó hexán izomerekkel (Skellysolve B) végezzük és 50 ml-es frakciókat gyűjtünk az alábbiak szerint: 40 Frakció Oldószer 1. Skellysolve B, 2. 40 ml Skellysolve B, 10 ml etilacetát 3. 30 ml Skellysolve B, 20 ml etilacetát 45 4. 25 ml Skellysolve B, 25 ml etilacetát 5. 20 ml Skellysolve B, 30 ml etilacetát 6. 10 ml Skellysolve B, 40 ml etilacetát 7. 5 ml Skellysolve B, 45 ml etilacetát 8. etilacetát 50 9. etilacetát 10. etilacetát 11. etilacetát 12. 100 ml etilacetát A 6—12. frakciókat egyesítjük és aoeton-Skellysolve B (hexán izomerek) elegyből kristályosítjuk. A kristályokat szűréssel elkülönítjük, éterrel mossuk és szárítjuk. így 30 mg kristályos PGEi-et kapunk, melynek olvadáspontja 115—116°, autentikus PGEi-el kapott keverékolvadáspontja pedig 114—114,5°. Optikai forgatóképességi diszperziós görbéje az autentikus PGE] optikai forgatóképességi diszperziós görbéjével azonos. 24