161003. lajstromszámú szabadalom • Eljárás PGF1 típusú protaglandin- analógok előállítására

161003 47 48 hidrogénperoxidot adagolunk be, mimellett a hőmérsékletet 10° alatt tartjuk. Az elegyet ezután 35 percig szobahőmérsékleten keverjük és a rétegeket elválasztjuk. A vizes fázist kétszer éterrel és háromszor etilaoetáttal extraháljuk. A szerves oldatokat egyesijük és telített vizes nátriumklomd-oldattal mossuk, majd magnéziumszulfát felett szárítjuk, szűrjük és' csökkentett nyomáson bepároljuk. Így 89 g maradékot kapunk, amely 6-karbetoxi-biciklo[3.1.0]hexán-3-ol és 6~karbetoxi-biciklo[3.1.0]hexán-2--ol elegyéből áll, és főleg a 3-olt tartalmazza. 19. példa: 6-KarbetoxÍJbiaiklo![3.1.0] hexán-3-ol tetrahidropiranil-éter és 6-karbetoxi-bieiklo[3.1.0]hexän-2-ol tetrapiranil-éter. 88,0 g 6-karbetoxi-biciklo[3.1.0]hexán-3-olból és 6-karbetoxi-biciklo[3.1.0]hexán-2-olból álló elegyet és 88 ml dihidropiránt Ö°-ra hűtünk és 40 csepp foszf'oroxikloridot adunk hozzá. Az elegyet 0°-on 2 óra hosszat, majd szobahőmérsékleten 18 órán át keverjük. Az elegyet ezután metilénkloriddal hígítjuk és telített vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattal mossuk. A rétegeket elválasztjuk és a vizes fázist három ízben metilénkloriddal extraháljük. A szerves fázisokat egyesítjük és vízzel mossuk (a mosóvizeket visszaextraháljuk), nátriumszulfát felett szárítjuk és csökkentett nyomáson bepároljuk, amikoris maradékot kapunk. Ezt csökkentett nyomáson desztilláljuk; előbb 18 g előpárlatot kapunk amely 4Ö°-on forr 1,3—0,4 Hg mm nyomáson, ezután 75,3 g 6~karbetoxi-bicikla[3.1.0]hexán-3-ol tetrahidropiranil-éter és 6-karbetoxi-biciklo[3.1.0]hexán-2-ol tetrahidropiraniléter elegyet kapunk, 98—131° (0,3—1,0 Hg mm) forrásponttartományon belül. 20. példa: PGEj, PGEi-metilészterből. A. Enzim-készítés. Táptalajt készítünk, amely 2% kukoricalekvárt (cerélóz és glükóz egyenlő részarányú keveréke) tartalmaz csapvízben. Ezt sósav hozzáadásával 4,5 pH-ra megsavanyítjuk és 1% metiloleátot adunk hozzá. Négy darab 500 ml-es lombikban a fenti táptalajból 100—100 ml-t helyezünk el és beoltjuk Cladosporum resinae (C 1—11, ATOC 11.274)-vel, majd szobahőmérsékleten (kb. 28°) 4 napig rázatjuk. A tenyészetet ezután 40 ml-es centrifuga-csövekbe helyezzük és klinikai centrifugában kb. 2000 ford/ /perc sebességgel centrifugáljuk. A centrifugacsövekből származó folyadékot dekantáljuk és az összegyűjtött sejteket hideg- vízzel mossuk. Két centrifugáló-osőből a mosott sejtekét felszuszpendáljuk 50 ml jéghideg 0,05 mólos 7,0 10 IS 20 25 30 35 pH-jú foszfátpufferben és elhelyezzük egy jéggel hűtött kisméretű Waring keverőben. Üveggyöngyöket adunk hozzá és a szuszpendált sejteket 15 percig keverjük a keverőben. A kapott, zúzott sejteket tartalmazó szuszpenziót klinikai centrifugában szobahőmérsékleten 15 percig kb. 2000 ford./perc sebességgel centrifugáljuk, majd a szupernatáns folyadékot összegyűjtjük. Ez a szupernatáns folyadék Cladosporium resiinae acilázt tartalmaz, és azt közvetlenül felhasználhatjuk PGEi-alkilészterek hidrolizálására, vagy előnyösen fagyasztva tárolhatjuk, ameddig az szükséges. B. A PGEi-metiiószter észteráz-hidrolízise. A példa A. pontjában leírt módszerrel előállított Cladosporium resinae acilázt tartalmazó szupernatáns folyadékból 10 ml-t és 50 mg PGEi-metilésztert szobahőmérsékleten nitrogén alatt rázatunk kb. 19 óra hosszat, majd 70 ml aeetont adunk hozzá és az elegyet szűrjük; így szűrletet és oldhatatlan maradékot kapunk. Vékonyréteg-kromatográfiás analízis (szilikagél lemezen, előhívás kloroform-ecetsav-metanol 90 : : 5 : 5 : eleggyel) azt mutatja, hogy úgy a szűrlet, mint a szűréssel kapott oldhatatlan maradék PGEi-et tartalmaz. A szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk, és így 40—50 mg kissé sárga olajat kapunk, ami PGEi—bői áll. Ezt az olajat és az oldhatatlan maradékot egyesítjük és 10 g savval mosott szilíkagélen (Silic ARCC—4, Mallinckrodt) kromatografáljuk. Az eluálást növekvő mennyiségben etilacetátot tartalmazó hexán izomerekkel (Skellysolve B) végezzük és 50 ml-es frakciókat gyűjtünk az alábbiak szerint: 40 Frakció Oldószer ••' 1. Skellysolve B, ••' 2. 40 ml Skellysolve B, 10 ml etilacetát 3. 30 ml Skellysolve B, 20 ml etilacetát 45 4 25 ml Skellysolve B, 25 ml etilacetát 5. 20 ml Skellysolve B, 30 ml etilacetát 6. 10 ml Skellysolve B, 40 ml etilacetát 7. 5 ml Skellysolve B, 45 ml etilacetát 8. etilacetát 50 9. etilacetát 10, etilacetát 11. etilacetát 12. 100 ml etilacetát 55 60 85 A 6—12. frakciókat egyesítjük és aceton-Skellysolve B (hexán. izomerek) elegyből kristályosítjuk. A kristályokat szűréssel elkülönítjük, éterrel mossuk és szárítjuk. Így 30 mg kristályos PGEi-et kapunk, melynek olvadáspontja 115—116°, autentikus PGEi-el kapott keverékolvadáspontja pedig 114—114,5°. Optikai forgatőképességi diszperziós görbéje az autentikus PGE] optikai forgatóképességi diszperziós görbéjével azonos. 24