160813. lajstromszámú szabadalom • Eljárás PGA-típusú prosztaglandin-analógok előállítására

45 A fenti eljárást követjük, de kiindulási anyagként /^izomert használunk, és így ugyanilyen eredményeket kapunk. 18. példa 6-Karbetoxi-biciklo[3.1.0]hexan-3-ol és 6-karbetoxi-biciklo- [3.1.0] hexan-2-ol. 96,46 g 64sarbetoxi-biciM0[3.1.O]hexén 500 ml száraz éterrel készült oldatát nitrogén alatt keverjük és szobahőmérsékleten cseppenként hozzáadaigoljuk 266 ml 0,1 mólos bórhidricktóatnak mintegy a felét. A reakcióelegyet 0°-ra lehűtjük és a maradék bórhidrid-oldatot hozzáadjuk. A bórhidrid-oldat hözzáadagolásához kb. 45 perc idő szükséges. A reakcióelegyet ezután szobahőmérsékletén 45 percig keverjük, és az oldószert csökkentett nyomáson végzett bepárlással eltávolítjuk. A maradékot 500 ml éterben oldjuk és 0°-ra hűtjük jeges-metanolos hűtőfürdővel. Ezután 10—15 perc alatt 150 ml 3 n vizes nátriumhidroxid-oldatot adunk hozzá, miközben a hőmérsékletet 5° alatt tartjuk, ezt követően 15 perc leforgása alatt 80 ml 30%-os hidrogénperoxidot adagolunk be, mimellett a hőmérsékletet 10° alatt tartjuk. Az elegyet ezután 35 percig szobahőmérsékleten keverjük és a rétegeket elválasztjuk. A vizes fázist kétszer éterrel és háromszor etilacetáttar extraháljuk. A szerves oldatokat egyesítjük és telített vizes nátriumklorid-oldattal mossuk, majd magnéziumszulfát felett szárítjuk, szűrjük és csökkéntett nyomáson bepároljuk. Így 89 g maradékot kapunk, amely 6-karbetoxi-bicikio-[3.1.0]hexän-3--Ql és 6-karbétoxi-biciklo [3.1.0] hexän-2-öl elegyéből áll, és főleg a 3-olt tartialrrnazz». •>..;.-19. példa 6-Karbetoxi-biciklo[3.1.0.]hexán-3-ol tetrahidropiranol-éter és 6-kárbetóxi-biciklo[3.1.0.] ehxan-2-ol tetrapiranil-éter. 88,0 g 6-karbetoxi-biciklo[2.1.0.]hexan-3-olból és 6-karbetoxi-biciklo[3.1.0.]hexan-2-olból álló elegyet és 88 ml dihidropiránt 0°-ra hűtünk és 40 csepp foszforoxikloridöt adunk hozzá. Az elegyet 0°-on 2 óra hosszat, majd szobahőmérsékleten 18 órán át keverjük. Az'elegyet ezután metilénkloriddal hígítjuk és telitett Vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattal mossuk. A rétegeket elválasztjuk és a vizes fázist három tóben metilénkloriddal extraháljuk. A szerves fázisokat egyesítjük és vízzel mossuk (a mosóvizeket viszszaextraháljuk), nátriumszulfát felett szárítjuk és csökkentett nyomáson bepároljuk, amikoris maradékot kapunk. Ezt csökkentett nyomáson desztilláljuk; előbb 18 g előpárlatot kapunk, amely 40°-on forr 1.3—0.4 Hg mm nyomáson, ezután 75,3 g 6-kárbetoxi-biciklo[3.1.0]hexan-3-ol tetrahidropiranil-éter és 6-karbetoxi-bíciklo[3:••} 1.0]hexan-2-ol tetrahidropiranüéter elegyet kapunk, 98—131° .(0,3—1,0 Hg mm) forrásponttartomártyon belül. 46 .20. példa PGE,i, PGEi-metilészterből. A) Enzimkészítés. Táptalajt készítünk, amely 2% kukoricalekvárt (cerelóz és glükóz egyenlő részarányú keveréke) tartalmaz csapvízben. Ezt sósav hozzáadásával 4,5 pH-ra megsiavanyítjük és 1% metiloleátot adunk hozzá. Négy darab 500 ml-es lombikban a fenti táptalajból 100—100 ml-t helyezünk el és beoltjuk Cladosporum resinae (C 1—11, ATCC 11.274)-vel, majd szobahőmérsékleten (kb. 28°) 4 napig rázatjuk. A tenyészetet ezután 40 ml-es centrifuga-csövekbe helyezzük és klinikai centrifugában kb. 2000 ford/perc sebességgel centrifugáljuk. A centrifuga-csövekből származó folyadékot dekantáljufc és az összegyűjtött sejteket hideg vízzel mossuk. Két centrifugáló-csőből a mosott sejteket felszuszpendáljuk 50 ml jéghideg 0,05 mólos 7,0 pH-jú foszfátpufferben és elhelyezzük egy jéggel hűtött kisméretű Waring keverőben. Üveggyöngyöket adunk hozzá és a Szuszpéndált sejteket 15 percig keverjük a keverőben. A kapott, zúzott sejteket tartalmazó szuszpenziót klinikai centrifugában szobahőmérsékleten 15 percig kb. 2000 ford/perc sebességgel centrifugáljuk, majd a szupernatáns folyadékot összegyűjtjük. Ez a szupernatáns folyadék Gladosporium resinae acilázt tartalmaz, és azt közvetlenül felhasználhatjuk PGEj-alkilészterek hidrolizálására, vagy előnyösen fagyasztva tárolhatjuk, ameddig az szükséges. b) A PGEi-metüészter észteráz-hidrolízise. A példa A) pontjában leírt módszerrel előállított Cladosporium resinae acilázt tartalmazó -szupernatáns folyadékból 10 ml-t és 50 mg PG -metilésztert szobahőmérsékleten nitrogén alatt rázatunk kb. 19 óra hosszat, majd 70 ml acetont •adunk hozzá és az elegyet szűrjük; így szűrletet és oldhatatlan maradékot kapunk. Vékonyrétegkromatográfiás analízis (szilikagél lemezen, előhívás kloroform-ecetsav-Jmetanol 90:5:5:eleggyel) azt mutatja, hogy úgy, ja szűrlet, mint a szűréssel kapott oldhatatlan maradék PGEi-et tartalmaz. A szűrletet csökkentett nyomáson bepároljük, és, így 40—50 mg kissé sárga olajat kapunk, ami PGEi-ből áll. Ezt az olajat és az oldhatatlan maradékot egyesítjük és 10 g savval mosott szilikagélen (Silic ARCC—4, Mallinckrodt) kromatögrafáljuk. Az eluálást növekvő* mennyiségben etilacetátot tartalmazó hexán izomerekkel (Skellysolve B) végezzük és 50 ml-es frakciókat gyűjtünk az alábbiak szerint: Frakció , Oldószer 1. Skellysolve B, 2. 40 ml Skellysolve B, 10 ml etilacetát 3. 30 ml Skellysolve B, 20 ml etilacetát 4. 25 ml Skellysolve B, 25 ml etilacetát 5. 20 ml Skellysolve B, 30 ml etilacetát 23