160758. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klinikai célokra alkalmas, infektálható inzulinkészítmény előállítására

15 mum 8. példa: A következei összetételű pufferoldatot állítjuk elq: 1,25 kg trisz-(hidrQximetil)-amino[met4n, 725 ml 12,3 M H0, 62,4 liter 96 térf .%-os etanol, víz (ad 10Ó liter). A pufferoldat pH-ja 25 °C-an 7,3, A pufferoldatbail 1,3 liter QAE-Sephadex— —A—25 ioncserélő gyantát duzzasztunk, és a finomabb részecskéket dekantálással eltávolítjuk. A gyantával 15 cm átmérőjű, 25 cm magasságú oszlopot töltünk meg, és az oszlopot a pufferoldattal egyensúlyba hozzuk. 18 g, qitrát-púfferböl egyszer kristályosított inzulint 0,72 g etiléndiamin-tetraeoetsav-dinátyiumsó, 10,2 g trisz-(hidroximetil)-aminometán és 720 ml 60 térO/g-os etanol elegyében oldunk. Az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítjuk, a tiszta oldathoz 10,7 ml 6 N HCl-t adunk, és az elegyet felvisszük az oszlopra. Az oszlopot 25 °C-on, 1,2 liter/óra sebességgel eluáljuk a fenti pufferoldattal, és az eluátumokat Q,5 literenként összegyűjtjük. A frakciók extinkcióját 276 nm-en megmérjük (E276), és az eluátum térfogatának függvényében, az 5. ábrának megfelelően grafikusan ábrázoljuk. Az inzulin-csúcs (legnagyobb csúcs) központi tartományéinak -megfelelő frakciókat egyesítjük, (az ábrán feltüntetett módon), és az inzulint az oldattal azonos térfogatú 0,02 M cinkacetát hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással elkülönítjük, és az ismert HQc>don, aceton-tartalmú qitrátpufferből kristályosítjuk. 8,2 g tiszta inzulint kapunk. Az inzulint a, következő összetételű pufferoldatból átkristájyosítjuk: 2,0% inzulin, 0,8% Zn++

(klorid-formában) (az inzulin súlyára számítva), 0,01 M náttriumaeetát, 7,0% nátriumklorid. Az oldat pH-ját sósavval 5,45—5,55 értékre állítjuk. Az inzulint sósavat és cinkkloridot tartalmazó vízben oldjuk, majd az oldathoz nátriumacetát-és nátriumklorid-oldat^t adunk. A kristályosítást szobahőmérsékletei*, mechanikai keverés közben végezzük, A kristályosodás 1—2 nap alatt befejeződik. Az inzulint szűréssel elkülönítjük, vízzel mossuk és, vákuumban szárítjuk. Hqzam: 8,0 g. A találmány szerint előállítható tisztított inzulint és tiszta inzulint klinikai használatra alkalmas inzulin-készítmények előállítására használhatjuk fel, Ismeretes, hogy az inzulint gyors hatás elérése céljából injektálható vizes oldatok formájában alkalmazzák. Az oldatok pH-ja általában 2—3 közötti érték, azonban kb. 7—8-as pH-jú inzulin-oldatot tartalmazó készítmények is. ismeretesek. Az utóbbi inzulin-oldatot pl. a 3.091.573 sz. USA-szabadalom ismerteti. A ta~ 10 15 20 25 30 4Q 45 50 35 €0 65 10 lálmány szerint előállítható tisztított, ill. tiszta inzulint mindkét típusú injektálható inzulin-oldat előállításához felhasználható. Olyan injektálható inzulin-készítmények is is-» méretesek, amelyek az inzulin mellett olyan segédanyagokat is tartalmaznak, amelyek a? inzulin oldhatóságát az emberi vér, ül. szövetek pH-tartományában erősen csökkentik. Ilyen segédanyag pl. a protamin, globin és surfén (bisz-2-metil-4-aminokindil-8-karbamid). Egy jól ismert, fenti típusú készítmény az amorf inzulin-csapadék és protamin cinktartalmú vizes közeggel készített szuszpenziója. Egy másik, hasonló típusú készítmény a kristályos inzulin és. protamin injektálható, vizes szuszpenziója. A találmány szerint előállítható tisztított, ill. tiszta inzulint a fenti típusú készítmények előállítására is felhasználhatjuk. Ismeretesek olyan injektálható inzulin-készítmények is, amelyek vizes szuszpenzióban amorf és/vagy kristályos inzulint tartalmaznak. Ezeket a készítményeket széles körben alkalmazzák. A fenti inzulin-kristályszuszpenziók 1 g szuszpendált inzulin-kristályra számítva legalább 0,35 milliekvivalens cink-iont tartalmaznak, és a szuszpenziók pH-ja 7 körüli érték. A fenti típusú injektálható inzulin-készítményeket a 2.882.202 sz. USA-szabadalom ismerteti. A találmány szerint előállítható tisztított, ill. tiszta inzulint a fenti típusú injekciók előállítására is felhasználhatjuk. Az utóbbi évtizedben olyan, kristályos bovin-inzulint tartalmazó, injektálható vizes szuszpenziókat is alkalmaztak, amelyek sík kristálylapokkal határolt, éles szélű, romboéderes kristályokat tartalmaznak, és a romboéderek tompaszögeinek nagysága 114° és 115° között változik. Ezek a kristályok pl. a 2.920.014 sz. USA-szabadalom szerint állíthatók elő. A fenti típusú bovin-inzulin kristályok szuszpenziója oldott inzulint is tartalmazhat. A találmány szerint előállítható tisztított, ill. tiszta inzulint a fenti típusú klinikai készítmények előállítására is felhasználhatjuk. Végül ismeretes, hogy az egyenlő méretűi kristályokat tartalmazó, injektálható inzulin-kristályszuszpenziók alkalmazása több szempontból előnyös. A lényegében egyenlő méretű kristályok előállítását pl. a 2.819.999 és 2.799.622 sz. USA-szabadalmak ismertetik. A találmány szerint előállítható tisztított ill. tiszta inzulint is alávethetjük a fenti szabadalmakban ismertetett kristályosítási eljárásnak. Az alábbi példákban a találmány szerinti tisztított, ill, tiszta inzulint tartalmazó inzulin-készítmények előállítását ismertetjük. 9. példa: 40 NE/ml koncentrációjú, semleges inzulin-injekció 160 mg, a 6. példa szerint előállított tiszta inzulint 20 ml 0,01 N sósavoldatban oldunk. Az oldatot szűréssel sterilizáljuk, és a szűrletet