160758. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klinikai célokra alkalmas, infektálható inzulinkészítmény előállítására

Ismeretesek már eljárások a kristályos inzulin gél-szűrés útján történő tisztítására, és önmagában ismeretes volt már oly eljárás is, amelynek során a pancreas savas alkoholos kivonatát cszlop-kromatográfiával, kationcserélő gyantán tisztítják, nem volt azonban eddig ismeretes, hogy a gél-szűrés és az előnyösen erősen bázisos ioncserélővel végzett oszlop-kromatográfiás tisztítás egymással kombinálható és hogy ezáltal rendkívül nagy tisztaságú, a fentebb megadott különleges analitikai követelményt kielégítő, poliakrilamid-gél-elektroforézissel egységes anyagnak mutatkozó inzulin állítható elő, minthogy ez a kétféle tisztítási mód előre nem látható módon kiegészíti egymás hatását. A találmányunk szerinti tisztasági követelményeket kielégítő inzulin sem gél-szűréssel egymagában, sem ioncserélő oszloppal végzett ismert kromatográfiás eljárásokkal egymagukban nem állítható elő. A találmány szerinti kombinált tisztítási eljárás során a gélszűrést előnyösen vizes közegben végezzük (a vizes közeg adott esetben vízzel elegyedő, nem-vizes komponenseket is tartalmazhat), kívánt esetben azonban az eljárást kevés vizet tartalmazó szerves oldószerekben is végrehajthatjuk. Ha a gélszűrést vizes közegben végezzük, a közeg pH-ját célszerűen 2—4 közötti értéken tartjuk. pH = 2 alatt és pH = 9 fölött ugyanis az inzulin stabilitása csekély és bomlástermékek képződhetnek. Ennek megfelelően az eljárás végrehajtására a nagyon kis, vagy nagyon nagy pH-értékű közegek kevéssé alkalmasak. Ha az inzulin oldhatóságát megnöveljük, a gélszűrést pH = 4—9 értéken is végrehajthatjuk. Oldhatóságnövelés céljából íz inzulinhoz pl. karbamidot adhatunk, amely az inzulin-molekulák egymással, ill. szennyező anyagokkal semleges közegben végbemenő aszszociációját is megakadályozza. Ha az eljárást kis pH-értékeken végezzük, a pH beállítására előnyösen szerves savakat, pl. ecetsavat alkalmazhatunk, a pH beállítást azonban erős ásványi savakkal is végezhetjük. Előnyösen 0,5—4M koncentrációjú ecetsavat alkalmazunk. A gélszűrés hőmérséklete nem döntő jelentőségű, a hőmérsékletet lényegében az inzulin stabilitása és oldhatósága határozza meg. Általában előnyös szobahőmérséklet körüli hőfokon, pl. 20—25 °C-on végezzük a gélszűrést. Az inzulint tartalmazó (c) komponens megjelenése előtt elkülönített frakciókat elöntjük. A (c) komponenst tartalmazó, 6000-nél nagyobb molekulasúlyú anyagoktól mentes frakciókat egyesítjük, és az inzulint pl. bepárlással, kisózással, vagy cinkionokkal végzett kicsapással elkülönítjük. A lehető legkisebb antitest-képző hatással rendelkező inzulinkészítmények előállítása céljából az inzulinnal csaknem azonos molekulasúlyú, azonban az inzulintól kissé eltérő kémiai szerkezetű anyagokat is el kell különíteni. Ilyen anyagok pl. az ismert mono-dezamido-inzulin, 3 és a korábban említett, új aTginin-inzulin. Csekély mennyiségű mono-dezamido-inzulin a gyógyászati inzulin-készítmények tárolása során is képződhet annak ellenére, hogy ezt a kom-5 ponenst teljes mértékben eltávolítottuk; a vegyület antitest-képző hatása azonban kérdéses és így eltávolításának nincs nagyobb jelentősége. Az arginin-származékot és a diamidált inzulint a gél-szűrést követő, célszerűen erő-10 sen bázisos ioncserélővel végzett ioncserés oszlopkromatográfiával távolítjuk el. Az ioncserés eljárásban eluálószerként víztartalmú szerves oldószert, előnyösen vízzel elegyedő szerves oldószert alkalmazunk. Az oils dószerek a következő anyagok lehetnek: tetrametil-karbamid, dimetilformamid, dioxán, vízzel elegyedő ketonok, így aceton, rövidszénláncú alkanolok, így metanol, etanol vagy propanol. Oldószerként előnyösen alkoholokat al-20 kalmazunk. Az eluálószer alkohol-koncentrációja 30—80 térf.%, előnyösen 50—70 térf.% lehet. Ha az eluálószer 50 térf.%-nál kevesebb vízzel elegyedő szerves oldószert tartalmaz, a 25 rendszert lényegében vizes közegnek nevezhetjük. Ebben az esetben az eluálószerhez annyi karbamidot adhatunk, hogy 4—8 mólos, előnyösen kb. 7 mólos karbamid-oldatot kapjunk. Karbamid-oldatok felhasználása esetén ügyel-20 nünk kell arra, hogy az oldat ne tartalmazzon ammóniumcianátot, mert a cianát-ion az inzulin-molekula amino-csoportjávai reakcióba lép. Az eluálószerhez a pH-beállítás céljából pufferanyagokat adunk. Az eljárást előnyösen ál-35 landó pH-értéken végezzük. Ha kationcserélőt alkalmazunk, az eluálószer pH-ját 3—6,5 közötti, előnyösen 4—6 közötti értékre állítjuk be, míg anioncseo-élők alkalmazása esetén az eluálószer pH-ját 5,5—10 közötti, előnyösen 6—9 közötti 40 értéken tartjuk. A pH-értékeket standard pufferoldattal szemben, üvegelektróddal határozzuk meg. Pufferanyagként az irodalomban ismertetett rendszereket alkalmazhatjuk. 45 Az ioncserés eljárás során a hőmérsékletet lehetőleg állandó értéken kell tartani. Általában —10 és 4-40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 0—30 °C-on dolgozunk, ill. ha eluálószerként vizes karbamid-oldatot alkalmazunk, a 50 tisztítást célszerűen 5 °C alatti hőmérsékleten végezzük. A tisztítási eljárás során kiindulási anyagként a kereskedelemben kapható inzulin-anyag5 gokat, azaz

amorf, vagy kristályos (adott esetben többször kristályosított) inzulint alkalmazhatunk. Az eljárás során kiindulhatunk nyers inzulinból is, pl. az inzulin hasnyálmirigyből történő elválasztása során kapott, általában 10—30 súly% inzulint tartalmazó sós elegyből, ez az anyag azonban nagymértékű szennyezettsége miatt a fenti tisztítási eljáráshoz kevésbé alkalmas. Megfelelőbb kiindulási anyaghoz juthatunk, ha az inzulintartalmú sóelegy oldatából 85 a nyers inzulint izoelektromos kicsapással (pH = 4