160758. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klinikai célokra alkalmas, infektálható inzulinkészítmény előállítására

166758 6 A találmány szerint előállítható új inzulin-készítményt a szervezet meglepő módon sokkal jobban elviseli, mint az ismert inzulin-készítményeket. A jelenséget azzal magyarázhatjuk, hogy az ismert inzulin-készítményekben jelenlevő (a) és (b) komponensek meglepően erős antitest-képző, és nyilvánvalóan, diabetogén anyagok, ezzel szemben az új inzulin-készítmények nem váltanak ki antigén-antitest reakciót. A fenti állítást állatokon végzett toxicitási vizsgálatokkal igazoltuk. Kísérleti i állatként nyulat használtunk fel, ugyanis a nyúlon az ismert inzulin-készítmények az emberével azonos antitest-reakciót váltanak ki, vagyis a képződött antitestek inzulinmegkötő képessége és inzulin-affinitása azonos. (Tengerimalacokon lényegesen nagyobb inzulinmegkötő képességű és inzulin-affinitású antitestek képződnek. A nyúl-inzulin az emberi inzulintól csak a B 30-as helyzetben tér el, ez az aminosav a nyúl-inzulinban szerin, és az emberi inzulinban treonin. A tengerimalac-inzulin 18 aminosav helyzetében tér el az emberi inzulintól.) A nyulaknak hetente háromszor azonos menynyiségű fehérjét (40 ^g/1 ml 0,04 M, 7,4 pH-jú nátriumfoszfát-puff er) adtunk be injekció formájában. Inzulin esetében ez a mennyiség kb. 0,5 NE/kg-nak felel meg, ez kb. azonos a diabetes kezelésében felhasznált átlagos . dózissal. Szabályos időközönként ismert módszerrel meghatároztuk a vérszérum antitest-tartalmát. Az antitest-tartalmat a mintában az. antitestekhez kötött 125I-inzulin (marha-inzulin) %-ában fejeztük ki. Az eredményeket a 3. ábrán foglaljuk össze. Az alábbi négy eredmény közül különösen a két első tekinthető rendkívül meglepőnek és a várakozással ellentétesnek. 1. A kizárólag tiszta inzulint tartalmazó készítmények nem váltanak ki inzulin-antiíest-képződést. 2. Az (a) komponens (amely nem inzulin), rendkívül nagymértékű inzulin-antitest-képződést idéz elő. A jelenség magyarázata valószínűleg az, hogy az (a) komponens az inzulinhoz kémiailag hasonló, ismeretlen anyagot tartalmaz. 3. Az általánosan alkalmazott, nagytisztaságú inzulin (azaz az átkristályosítótt inzulin) az emberi szervezetben észlelttel azonos antitest-képződést vált ki. 4. A (b) komponens 3. frakcióját képező anyag (lásd: 1. ábra), valamint a dimer és a proinzulin inzulin-antitest-képződést okoz. Az ábrán nem tüntettük fel azt az eredményt. hogy a (c) komponensben található „arginin-inzulin" 45 napos kezelés után csekély, de jelentős mennyiségű antitest képződéséhez vezet; emellett az még nincsen teljesen kizárva, hogy a mono-dezamido-inzulinnak van-e antigén hatása. A kísérletek során azt tapasztaltuk, hogy a (b) komponenssel, s ezen belül elsősorban a 10 15 20 25 30 S3 40 45 50 S5 60 613 dimerrel kezelt nyulak vércukorszintje növekedik. A vizsgált ainyagok közül nein a dimer váltja ki a maximális antitest-képződést, azonban, ismeretlen okokból, a dimerrel kezelt állatok vércukorszintje volt a legmagasabb. Ennek megfelelően a (b) komponens, és elsősorban a dimer diabetogén (vagy anti-inzulin-szerű) hatással rendelkezik, tekintettel arra, hogy az állatok inzulinnal szemben ellenállóvá váltak (lásd: 4. ábra). Az állatokat 14 héten át hetente háromszor 40 jug, marha-inzulinból izolált dimerrel kezeltük, majd a nyulakat 16 órára kikötöttük, és ezután intravénás injekcióban 0,5 NE/kg menynyiségű inzulint adtunk az állatoknak. A kontroli-csoport állatait tiszta inzulinnal kezeltük. A vérszérum glükóztarta'siiát a 4. ábrán tüntetjük fel. A görbékből látható, hogy a kontroli-csoport állatai a várt reakciót adják, míg a (b) komponensből izolált dimerrel kezelt állatok inzulin-rezisztenssé váltak. A vércukorszint emelkedését a kialakult inzulin-rezisztenciával magyarázhatjuk, az inzulin-rezisztencia okát azonban nem ismerjük. A jelenség az egyes, ismert inzulin-készítménnyel kezelt betegeknél fellépő inzulin-rezisztenciához hasonló. A fentiek alapján azt várhatjuk, hogy a (b) komponenst és dimert nem tartalmazó inzulin-készítmények alkalmazásával a klinikai rezisztencia megszüntethető. Az ismert inzulin-készítmények szennyezéseinek biológiai hatására vonatkozó adatok birtokában eljárást dolgoztunk ki rendkívül nagy tisztaságú inzulin előállítására. A tisztítást elvben a fehérjék tisztítására alkalmazott eljárások szerint rendkívül sokféleképpen végrehajthatjuk. A tisztítást kristályosítással, frakcionált kicsapással, elektroforézisseí, elektromos kicsapással vagy membránszűréssel végezhetjük, elönvösen azonban oszlopkromatográfiás módszert alkalmazunk. E módszerek megfelelő kombinációja útján olyan, eddig sem ioarilag, sem tudományos célokra elő nem állított tisztaságú inzulint készíthetünk, amely megfelel a fentebb megadott különleges analitikai módszerrel meg. határozott tisztasági követelményeknek- és így alkalmas a találmánv szerinti injektálható inzulinkészítmény előállítására. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös foganatosítási módja értelmében oly módon járunk el, hogv a kereske'Te1

mi minőségű inzulint vagv a legalább 10 súly% inzulintartalmú nyers inzulint gél-szűrésnek vetjük alá. maid ezt követően ioncserélő-oszlopon kromatografáljuk, mindkét esetben az inzulin-csúcsértéknek megfelelő tiszta inzulint tart^mazó frakciókat rgvűjtjük össze amelyek az említett két tisztítási művelet után a poliakrilamid-gél-elektroforézissel végzett analízis Során már egyhetes anyagúnak mutatkoznak és az Így kapott tiszta inzulint alakítjuk injektálható: inzulin-készítménnyé. 3