160758. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klinikai célokra alkalmas, infektálható inzulinkészítmény előállítására
3 " "'"•• 4 inzulin-koncentráció megnövekedése. A szérum-inzulin egy részét az antitestek megkötik. Az inzulin össz-koncentrációja, sőt a szabad inzulin koncentrációja is elérheti a normális fiziológiás állapotnak megfelelő inzjulinkonoentráció 10— 100-szorosát, s ez a nagy inzulinkoncentráció szövetkárosító hatással jár, így pl. elősegítheti az atherosclerosis kifejlődését, és károsíthatja a még meglevő /S-sejteket. Megállapítottuk, hogy a nagy koncentrációban jelenlevő inzulin meggátolhatja a ^-sejtek kiválasztódását. Az inzulin-antitestek tulajdonságait, és képződésük mechanizmusát az utóbbi 5—10 évben egyre fokozottabban tanulmányozták. Megállapították, hogy az antitest-képződésben az inzulin minőségének döntő szerepe van. A marha-inzulin, amely az emberi inzulintól a sertés-inzulinnál nagyobb mértékben különbözik (3, ill. 1 aminosav helyzete), a várakozásnak megfelelően a sertés-inzulinnál nagyobb mértékű antitest-képződést vált ki. Más részről a sertés-inzulin még malacokon is sertésinzulin-antitestek képződését okozza. A jelenséget mindeddig nem sikerült megmagyarázni, azonban feltételezték, hogy az injekció beadásának helyén fellépő nagy sertésinzulin-koncentráció következtében az állatok immunanyagtsrmeléae úgy módosul, hogy saját inzulinjuk ellen is antitesteket termelnek. A találmány szerinti eljárás legfontosabb jeliemjője tehát az, hogy az injektálható inzulia-készítmények előállítása a fent meghatározott különleges tisztasági követelményt kielégítő mértékben tisztított inzulint használunk fel. Emellett annak érdekében, hogy a mono-dezamido-inzulinnak a készítmény tárolása folyamán bekövetkező képződését gátoljuk, előnyösen 7 körüli pH-értékű készítményeket állítunk elő. A különböző méretű fehérjemolekulákat ismert módon úgy választhatjuk el, hogy a fehérje-elegyet olyan oldószerben oldjuk, amelyben a molekulák disszociálnak, és az oldatot malekulaszitán, pl. meghatározott pórusméretű, három irányban keresztkötéseket tartalmazó szerves anyagból készült oszlopon bocsátjuk át. Azt találtuk, hogy az 1 M ecetsavoldatban oldott kristályos inzulint Sephadex G—50 oszlopon három komponensre, és pedig a kb. 6000 feletti molekulasúlyú, pancreas-eredetű fehérjéket egyaránt tartalmazó (a) és (b) komponensekre, továbbá egy (c) komponensre frakcionálhatjuk. A komponenseket ismert módon, pl. kisózással, cinksóval végzett kicsapással, liofilizálással stb. különíthetjük el oldataikból. A kristályosított inzulin kb. 2—5 súly% (a) komponenst, míg az átkristályosított inzulin 1 súly%-nál kevesebb (a) komponenst tartalmaz. A (b) komponens mennyisége mindkét esetben kb. 4—8 súly%. A (b) komponens egy további műveletben közel azonos molekulasúlyú, azonban töltésük szempontjából eltérő fehérjékre bontható. A (b) komponens elemeinek szétválasztását DEAE Sephadex A 50 anioncserélő gyantán végeztük, a (b) komponenst trisz-(hidroximetil)aminoetánnal pufferolt, 7,7 pH-jú, 7 mólos karbamid-oldatban vittük fel a gyantára. A kísérlet eredményét az 1. ábrán tüntetjük fel. A 4., 6. és 7. csúcs ismert anyagoknak, azaz proinzulinnak, a közbenső terméknek, ill. a dimernek felel meg; a további csúcsoknak megfelelő anyagokat eddig nem azonosítottuk. Az anyagokat ismert módon különíthetjük el oldataikból. A (c) komponens ioncserés kromatográfiával ugyancsak több frakcióra bontható. A (c) komponens a tiszta inzulin főtermék mellett mono-dezamido-inzulint, és egy harmadik vegyületet tarta^az. Ezt a vegyületet — tekintettel arra, hogy arginin-tarta1ma nagyobb az inzulinénál — ,.ar»inm-inzulm"-nak nevezzük. A mono-dezamido-inzulin mennyisébe a (c) komponensben az inzulin eredetétől és előzetes kezelésétől függően változik, és általában 3—10 súly% lehet. Az arginin-inzulin mennyisége általában a (c) komponens 2—3 súly%-a. A 2. ábrán a szétválasztás eredménvét, és a komponensek elektroforetikus viselkedését mutatjuk be. A poliakrilamid-gél-elektroforé.zist Ornstein és Davis módszerével, 7,5% poliakrilamiddal, 8,9-es pH-jú közegben végeztük. A találmány szerint előállított inzulinkészítmények alkalmazásával kiküszöbölhetjük az ismert inzulinkészítmények felhasználásával járó inzulin-intoleranciát. A találmány szerint olyan új inzulin-készítményt állítunk elő, amely nem 5 tartalmaz bizonyos, az ismert inzulinkészítményekben mindig jelenlevő, az inzulinénál na-rgyobb molekulasúlyú anyagokat. A? új inzulin-ké3zítmény alkalmazása során a szervezetben egyáltalán nem, vagy csak rendkívül kis mér- 4Q tékben képződnek inzulin-antitestek. Ellentétben azzal a korábbi feltételezéssel, hogy az inzulin-antitestek képződését maga az inzulin okozza, meglepő módon azt találtuk, hogy az antitest-képződés okozója nem az inzulin, ha- . nem az említett, inzulinnál nagyobb molekulasúlyú anyagok. A találmány szerint előállított inzulin-készítmények mentesek a pancreas-eredetű, kb, 6000- fl nél nagyobb molekulasúlyú fehérjéktől; a találmány szerinti injektálható inzulin-készítmények cé'.jaira az inzulin olymértékben tisztítandó, hogy az egy különleges analitikai eljárással, az ismert nem-folytonos po^akri1 - rts amid-gél-elektrof orézissel (ez az ún. DISC PAGE eljárás, amelynek ez az elnevezése a „discontinuous Polyacrylamide gel electrophoresis" szavak kezdőbetűinek összeolvasásából származik) vizsgálva, egyetlen foltot mutasson, tehát egyséfes anyagnak mutatkozzék, Ezt az analitikai módszert L. Ornstein [Ann. N, Y. Acad. Sei., 121, 321 (1964)1 és B. J. Davis [Ahn. N. Y Sei., 121, 404 (1964)] ismertetik; a vizsgálatot karbamid hozzáadásával folytatjuk le. «5 10 15 20 25 30 35 40 45 o0 55 60 2
