160678. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A16884 jelzésű antibiotikum előállítására

160678 17 magnéziumszulfát heptahidrát 2,00 g ionmentesített víz 1 liter A táptalaj pH-ja beáll 6,7-re. 7. példa: Az A16884 antibiotikum fermentációja 40 literes rozsdamentes acél fermentorba 24 liter, következő összetételű táptalajt öntünk: Antifoam A (habzásgátló szer, gyártja a Dow Corning cég) 0,20 g glükóz 5,00 g dextrin 50,00 g szójaliszt 25,00 g blackstrap melasz 3,00 g káliumbifoszfát 0,25 g kalciumkarbonát 2,50 g hideg csapvíz 25 literre. A kezdeti pH 6,5-re beáll, változtatás nélkül. A táptalajt 30 percig 120 °C-on sterilizáljuk, lehűtjük, majd 5% 6. példában előállított vegetatív inokulummal oltjuk be. A fermentációt 30 °C-on 66 óráig végezzük, steril levegővel 0,35 tf/tf/perc mértékben levegőztetve és mechanikus keverővel 420/perc fordulatszámmal keverve. A végső pH 7,5. Az A16884 antibiotikumot a 8. példában leírt módszerrel választjuk el a fermentléből. 18 10 IS 25 ?0 nitrilt, és az oldatot liofilizáljuk. A termelés 25—30 g szilárd anyag. A liofilizált preparátumot minimális mennyiségű vízben oldjuk, és 7,2 x 60 cm méretű, mikrokristályos cellulóztermékkel (Avicel, gyártja FMC Corporation) töltött oszlopra visszük fel, mely cellulózt előzőleg 70%-c-s vizes acetonitrilben szuszpendáltunk és acetonitrillel mostunk. A minta felvitele után az oszlopot egy oszloptérfogatnyi acetonitrillel mossuk, majd az aktivitást metanollal eluáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük, és kb. 200 ml térfogatra koncentráljuk, majd az aktivitást 10 térfogatnyi acetonnal kicsapjuk. A csapadékot leszűrjük, acetonnal mossuk és vákuumban szárítjuk. A termelés 9^12 g. 20 g fentiekben előállított és leírt anyagot minimális mennyiségű vízben oldunk, és 7,2 x 60 cm méretű szilikagéles oszlopra viszünk fel. A szilikagélt (Grade 950, gyártja a Davison Chemical) előzőleg vízzel, majd metanollal mostuk, végül 70%-os acetonitrilben szuszpendálva töltöttük az oszlopot. A minta felvitele után az oszlopot egy oszloptérfogatnyi acetonitrillel mossuk, és az aktivitást 70%-os acetonitrillel eluáljuk. A legaktívabb frakciókat egyesítjük, vákuumban szárazra pároljuk, és metanolban oldjuk, majd az aktivitást tízszeres térfogatú acetonnal kicsapjuk. A csapadékot leszűrjük, acetonnal mossuk, és vákuumban szárítjuk. A termelés 8 g. A kevésbé aktív frakciók még további 6 g anyagot adnak. 35 8. példa: A nyers A16884 antibiotikum monoammóniumsóként történő izolálása Kb. 60 liter, a 7. példában előállított táptalajt Hyflo Supercel-en (diatomaföld, gyártja a John-Manville Products Corporation) szűrünk. A szűrletet 9,6 x 150 cm-es, szénnel (Pittsburgh Cal. 12x40, gyártja a Pittsburgh Activated Carbon Co.) töltött oszlopba töltjük. Az oszlopot vízzel addig mossuk, amig a lefolyó oldat színtelen lesz, majd a szénen adszorbeált aktivitást az oszlopot 50%-os vizes acetonnal mosva nyerjük vissza. Az aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítjük, vákuumban az acetont lepároljuk, és az oldatot 5,9 x 104 cm méretű, IRA—68 gyantával (formiátciklusban) (anioncserélő, gyártja a Rohm and Haas Co., hangyasavval mosva alakítjuk át a gyantát formiátciklusba) töltött oszlopra visszük fel. Az oszlopot vízzel addig mossuk, amig a lefolyó oldat tiszta és színtelen, és az aktivitást 0,1 M ammóniumformátoldattal mossuk le. Az aktív frakciókat egyesítjük, ós 4,3x72 cm szén (Pittsburgh 12x40) oszlopon engedjük át. Az oszlopot hat oszlootérfogatnyi vízzel mossuk, és az aktivitást 30%-os vizes acetonitrillel mossuk le. Az aktív frakciókat egyesítjük, vákuumban ledesztilláljuk az aceto-40 45 50 55 60 65 9. példa: Az A16884 monoammóniumsójának tisztítása A 8. példában előállított liofilizált készítmény 1 g-ját 4 ml vízben oldjuk, és 2,60 cm-es, 80%os vizes acetonitrillel készített 175 ml Grade 950 szilikagéllel töltött oszlopra visszük fel. Az oszlopot acetonitril-víz (4:1) eleggyel eluáljuk. Az eluciót biológiai meghatározzással és papírkromatográfiával követjük. Az A16884 antibiotikumot monoammóniumsójaként tartalmazó frakciókat egyesítjük, szárazra pároljuk, kis térfogat dimetilszulfoxidban, majd néhány milliliter etanolban oldjuk és az aktivitást éterfelesleg hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot centrifugáljuk és vákuumban szárítjuk. Az A16884 antibiotikum monoammóniumsójának termelése 91 mg. 10. példa: Az A16884 antibiotikum sav-alakjának előállítása 200 mg A16884 monoammóniumsót 30 ml vízben oldunk és 6 ml Dowex 50X12 (H+

) gyantát (gyártja a Dow Chemical Co.) adunk hozzá. Az elegyet 30 percig keverjük, leszűrjük, a