160598. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikus hatású vegyületek előállítására

160598 11 12 marhahúskivonat 3 g tripton 5g élesztőkivonat 5 g glukóz lg keményítő 24 g kalciumkarbonát 2 g csapvízzel kiegészítve 1000 ml-re. A lombikot 5 napig 35 °C-on inkubáljuk percenként 280 fordulatú, 50,8 mm löketű forgó io rázógépen. 2. szaporítási művelet: Az 1. szaporítási műveletből származó 25 ml 15 fermentlevet aszeptikusán átviszünk egy 2 literes rázott lombikba, amely 500 ml fent említett steril táptalajt tartalmaz- A lombikot és tartalmát 3 napig 28 °C-on inkubáljuk egy percenként 280 fordulatú, 50,8 mm löketű forgó 2

o rázógépen. Fermentációs művelet: A 2. szaporítási műveletből származó 500 ml fermentlevet aszeptikusán átviszünk egy 14 literes fermentációs tartályba, amely 9,5 liter következő összetételű steril táptalajt tartalmaz: dextrin 50 g glukóz 5 g szójababliszt 35 g kalciumkarbonát 7g kobaltklorid 10~* mól csapvízzel kiegészítve 1000 ml-re habzásgátló (GE 60 = = szilikon emulzió) 10 ml A táptalajt sterilizálás előtt beállítjuk 8 pH-ra. 66—90 óra hosszat aerób körülmények között fermentálunk percenként 250 fordulattal keverve, percenként 4,5 liter/liter levegőt 22,5 att nyomás alatt bevezetve. Ennek az időszaknak a végén, a termelt antibiotikum titere 150— 225 /tg/ml csúcsértéket ér el, és hozzávetőleg állandó marad. A fermentációs közeg pH-ja kissé változik csak az antibiotikum termelés közben 6,8 és 7,3 értékek között. 2. példa: A 66—40 antibiotikum elkülönítése Az 1. példából származó teljes fermentlé pH-ját 6 n kénsawal beállítjuk 2 értékre. (Ebben a példában a mennyiségeket az 1. példa szerinti művelettel kapott 17 adag megsavanyított fermentlé egyesítésével kapott 170 liter fermentiere vonatkoztatjuk.) A savas fermentlét kb. 15 percig keverjük, majd megszűrjük. A micéliumot vízzel mossuk, és a mosófolyadékot egyesítjük a szűredékkel. A szűredék pH-ját 6 n ammóniumhidroxid-oldattal 7 értékre állítjuk be. A 25 30 35 40 45 50 55 60 C5 közömbösített szűredékihez a kalcium kicsapásához szükséges mennyiségű oxálsavat adunk, és megszűrjük. A szűredéket ammóniumhidroxiddal ismét közömbösítjük. Ezután a szűredéket 1500—2000 g IRC—50 Amfoerlite-et ammóniumfázisban tartalmazó kationcserélő oszlopra visszük fel. Az eluátumot kiontjuk, és gyantán vízzel mossuk, és 2 n ammóniumhidroxid-oldattal eluáljuk. 400 ml-es frakciókat gyűjtünk, és ezeket S. aureusszal (ATCC 6538P) vizsgáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük, és vákuumban szárazra bepárolva kb. 28 g nyers 66—40 antibiotikumot kapunk kb. 500 jug/mg titerrel. 3. példa: A 66—40 antibiotikum tisztítása A 2. példa szerint kapott 28 g nyers 66—40 antibiotikumot 100 ml desztillált vízben feloldjuk, és felvisszük egy hidroxilfazisban levő anionkicserélő oszlopra (Dowex 1X2). A gyantát (2000 g) vízben szuszpendálva felöntjük egy 63,5 mm átmérőjű és 914,4 mm magas oszlopra. Az oszlopot kb. 23 ml/pere sebességgel desztillált vízzel eluáljuk, 100 ml -es frakciókat gyűjtünk, és azokat vezetőképességük méréséve] és Staphylococcus aureus-szal vizsgáljuk. A vizsgálat alapján durván elválaszthatjuk az antibiotikumot tartalmazó eluált frakciókat az antibiotikummentesektől. Hogy a frakciókat valóban helyesen kombináljuk, mindegyik frakció egy részét papírkromatografáljuk. 2:1:1 arányú kloroform-metanol-17%-os ammóniumhidroxid rendszer alsó fázisát felhasználva. Minden papírt megpermetezünk ninhidrinnel, a hasonló anyagot tartalmazó eluátumokat egyesítjük, és liofilizálva kb. 5,7 g 66—40 antibiotikumot kapunk kb. 900 jug/mg titerrel. 4. példa: 66—40 antibiotikum-szulfát előállítása A 3. példában leírt módon készült 3,9 g 66— 40 antibiotikum bázist 60 ml vízben oldunk, és a pH-ját 6 n kénsawal 4,5-re állítjuk be. Az oldatot aktívszénnel keverjük kb. 1/2 óra hoszszat, és megszűrjük. A szűredéket kb. 1 liter metanolhoz adjuk. Szűrés és szárítás után 4,8 g szulfátsót kapunk kb. 640 /ig/mg titerrel. 5. példa: 66—40 antibiotikum tisztítása szulfátján keresztül 200 g Whatman 1. sz. cellulózport összekeverünk egy 2:1:1 arányú kloroform-metanol-17%os ammóniumhidroxid oldatrendszer 20 ml-nyi felső fázisával, és apró szegmensekben megtoltunk vele egy 6,34 mm átmérőjű és 508 mm magas oszlopot. Az oldatrendszer alsó fázisát átbocsátjuk az oszlopon, amíg szennyezések -•«