160598. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikus hatású vegyületek előállítására
160598 66—40 szolvát: 9 antiWotikum-szulfát mint metanol 13 [ajffl D (c=l%, vízben) + 1054% Elemanalízis, % talált számított c 32,52 33,14 H 6,33 6,39 N 9,32 9,66 SOt 33,90 33,13 Az összetétel a következő képletnek fele] meg: (CigH^NsOyfe-S H2S0 4 -2 CH 3 OH Ultraibolya abszorpció: átlátszó 220 és 400 m/t között. Mint már említettük, 66—40 antibiotikum állítható elő, ha M. inyoensis mikroorganizmust vizes táptalajon aerób, előnyösen süllyesztett körülmények között tenyésztünk. Kisebb mennyiségű antibiotikum előállítására palackokban vagy rázott lombikokban történő felületi tenyésztés is alkalmazható süllyesztett körülmények helyett. A mikroorganizmust szénforrást, például asszimilálható szénhidrátot tartalmazó tápanyagon tenyésztjük. Asszimilálható nitrogénvegyületre vagy fehérjetartalmú anyagra is szükség van. Előnyös szénforrások a glukóz, maltóz, mannóz, szacharóz, keményítő, kukorioakeményítő és hasonlók. Előnyös nitrogénforrások a kukoricalekvár, élesztőkivonat, szójababliszt, húspeptonok, kazeinhidrolizátumok, marhahűskivonat stb. Célszerűen ezeknek a szén- és nitrogénforrásoknak a kombinációit használjuk. Nyomelemek külön hozzáadására rendszerint nincs szükség, mert a táptalajokhoz csapvizet használunk, köbaltsók hozzáadása azonban előnyösnek bizonyult. A 66—40 antibiotikum a miíkroorganizmus növekedésére alkalmas bármely hőmérsékleten tenyészthető, például 20 és 40, előnyösen 25 és 35 °C között. Optimális termelést rendszerint 3—7 nap alatt érünk el. A közeg pH-ja fermentáció közben általában 7 közelében marad. A végső pH részben a jelenlevő puffertól függ, ha van ilyen, és előnyös sterilitás előtt kb. 8,0 értékre beállítani. Ha a tenyésztést nagy tartályokban végezzük, kívánatos oltóanyagot készíteni táptalajon a fermentációs közegnek a mikroorganizmus ferde tenyészetével vagy liofilizált tenyészetével való beoltásával. Az aktív oltóanyagot azután aszeptikusán átvisszük nagyobb tartályokba. Az oltóanyag készítéséhez használt közeg ugyanaz lehet vagy különbözhet az antibiotikumnak tartályokban való előállítására használt közegtől, feltéve, hogy a mikroorganizmus jól növekszik. A fermentáció befejeztével a fermentlé például a következőképpen dolgozható fel: Az egész fermentlé pH-ját ásványi savval, előnyösen vizes kénsawal kb. 2 értékre állítjuk be, amikor is a vízben oldható bázisos antibio-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 tikum felszabadul a micéliumból, és oldódik a vizes fermentációs közegben. Az egész keveréket megszűrjük, és a szűredéket közömbösítjük, majd oxálsavat adunk hozzá a kaleiumionok kicsapására. Ujabb szűrés és semlegesre való beállítás után (előnyösen ammóniával) a víztiszta közömbösített szűredéket ionkicserélő gyantán, előnyösen IRC—60 Amberlite típusú ammónium-fázisú gyantán bocsátjuk át. A kimerült fermentlevet kiontjuk, és az antibiotikumot a gyantáról vizes ammóniával eluáljúk. Az eluátumot bepárolva nyers 66—40 antibiotikumot tartalmazó maradványt kapunk, amelynek titere 500 jag/mg az alább leírt próba eredménye szerint. A nyers antibiotikum anionkicserélő gyanta alkalmazásával, például Dowex 1X2 vagy Am -berlite IRA 451S típusú gyantával tisztítható meg. A nyers antibiotikumot vizes oldatából adszorbeáltathatjuk az oszlopra, és onnan desztillált vízzel eluálhatjuk. Az így kapott anyag titere kb. 900 jug/mg. A nyers antibiotikum cellulózon végzett oszlopkromatografálással is megtisztítható 2:1:1 arányú kloroform-metanol-17%-os ammőnhmihidroxid oldószerrendszert alkalmazva. Az oldószerrendszer felső fázisát használjuk először az oszlop átnedvesítésére és az alsó fázist eluálás céljára. Az antibiotikum az oszlopra az említett oldószerrendszer felső fázisával alkotott tömény oldatból való adszorfoeáltatással vihető fel. A különféle készítmények jig/mg antibiotikum tartalom alakjában meghatározott titerét a szabványos gyűrűs-lemezes próba módszerrel állapíthatjuk rendszerint meg, Staphylococcus aureus ATCC 6538F mikroorganizmust alkalmazva. Ez a módszer teljesen; analóg az Oden és munkatársai „Antimicrobial Agents and Gher ruotherapy" (1963) című művében leírttal. Égy [ig antibiotikus hatású az antibiotikumnak az az anyagmennyisége, amely 16,3 ±0,9 mm-es hatásterületű gyűrűt ad a próba körülményei között, és /ig/mg egységekben fejezzük ki. A követikező példák szemléltetik a 66—40 antibiotikum savaddiöós sóinak előállítását, valamint a kiindulási anyagként használt 66—40 antibiotikum előállítását. 1. példa: Mieromonospóra inyoensis tenyésztése 1. szaporítási művelet: Aszeptikus körülmísiyek között liofilizált M. inyoensis tenyészetet (vagy ferde tenyészetből kapott sejteket) adunk egy 300 ml-es rázott lombikban 100 ml következő összetételű steril táptalajhoz: i
