160587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 16 alfa 17-dihiroxiszteroidok 16 alfa-/alfa-D-glukozid/-jainak előállítására
160587 3 4 Ezeknek az új glukozidoknak ösztrogén hatásuk van. Ennélfogva ugyanolyan módon és ugyanolyan célra használhatók, mint az ismert ősztrögének; az adagolás az egyes vegyületek hatásosságától függ. Nevezetesen a találmány szerinti eljárással készült vegyületek felhasználhatók melegvérű állatok (emlősök), például rágcsálók, kutyák, tehenek és birkák ovulációjának gátlására napi 0,1—100 mg parenterális alkalmazásával. Felhasználhatók továbbá, mint szaporodásgátló szerek, amelyek a petetranszport meggyorsításával, a nidáció gátlásával vagy a fiatal magzat reszorpciójának kiváltásával hatnak egereken, patkányokon és házinyulakon napi vagy egyszeri 0,1 mg—10 mg adagokban. A reakciákeverékből 1 ml-t 3 ízben 2—2 ml etilacetáttal extrahálunk. Az egyesített etilacetátos kivonatot vákuumban szárazra bepároljuk, és a bepárlási maradék felét 50 :50 arányú aoeton-víz elegyben oldva Eastman kromatogram lemezen kromatografáljuk, 8 :1 arányú kloroform-metanol elegyet használva kifejlesztő oldószerként. Az ösztriol-glukozid Rf = 0,15-nél mozgó foltot ad, míg az át nem alakult ösztriol Rf — 0,791-nél mozog. Mindkét folt kimutatható ultraibolya-abszorpciójuk vagy foszformoUbdénsavval való reakciójuk alapján. Papírkromatogramon etilacetát-víz rendszer alkalmazásával, a papírt 1 : 3 arányú víz-aceton keverékbe való mártással megnedvesítve és az acetont elpárologni hagyva, az ösztriol-glukozid Rf = 0,35-tel, az ösztriol Rf = 0,95-itel mozog. Permetezőszerként Kiefifer-íéle vas(III)cianoferrát(III) reagens használható. 2. példa: 400 mg Clarase vagy 400 mg Rhozyme—S enzimkészítményt feloldunk 500 ml vízben, és 10 15 20 25 30 S5 40 45 50 55 60 A következő példák szemléltetik a találmány szerinti eljárást. A hőmérsékleteket Celsius-fokokban közöljük. 1. példa: Az ösztriol 16a-(a~D-glukozid)-ja a) Enzimkészítés Aspergillus niger NRRL 337 penésztörzset tenyésztünk Czapek-féle ferde agáron 1 hétig 25°-on. A spórákat 5 ml 0,01%-os vizes nátriumlaurilszulfát-oldatban szuszpendáljuk, és ezzel a szuszpenzióval beoltunk tíz 500 ml-es Erlenmeyer-lornibifcban levő következő összetételű 100—100 ml steril táptalajt: kukoricaliszt 20 g amimóniuimszulfát 2 g káliumdihidrogénfoszfát 1 g magnéziurnszulfat-heptahidrát 0,5 g vasszulfát-heptahidrát 0,01 g kalciumkarbonát 5 g vízzel kiegészítve 1 literre A lombikokat rázógépen (100 fordulat percenként és 5 cm löket) 64 óra hosszat 30°-on inkubáljuk, mire bőséges micélium fejlődik. A tenyészetet megszűrjük, és az amiláz enzimet tartalmazó szűredéket felhasználjuk a b) lépésben. b) Ösztriol-16a-(a-D-glukozid) szintézise enzimmel Az a) lépésben kapott 500 ml szűrt tenyészethez hozzáadunk 10 g maltózt 200 ml vízben és 100 ml 5,0 pH értékű Mcllvaine-féle pufferban oldva. 100 mg ösztriolt feloldunk 100 ml 50 : 50 arányú aceton-víz elegyben, és ezt az oldatot is hozzáadjuk. A reakciókeveréket 30°-on 16 óráig inkubáljuk, amikor is az ösztriol-glukozid keletkezése kimutatható a következő módon. c) Az öszíriol-16a-(a-D-glukozid) elkülönítése •és jellemzése 20 A b) lépésben kapott 1 liter reakciókeveréket 1 óra hosszat 4 g aktívszénnel rázunk. Szűrés és kis mennyiségű vízzel való mosás után az aktívszenet 4 ízben, 30—30 percig, 40—40 ml 50 : 50 arányú aceton-víz eleggyel rázzuk, az 25 atotívszenet minden rázás után szűrőre vive. Az egyesített vizes-acetonos eluátumot, amely így az ösztriol-glukozidot és az átalakítatlan ösztriolt tartalmazza, a vizes-acetonos eluátummal azonos térfogatú benzollal megosztjuk. A 30 megosztást megismételjük olyan benzollal, amelyet egyensúlyba hoztunk azonos térfogatú 50:50 arányai aceton-víz eleggyel. Ekkor az át nem alakult ösztriol zöme a benzolos fázisban van, az ösztriol-glukozid pedig teljes egészében a vi-35 zes-acetonos fázisban marad. A vizes-acetonos fázist vákuumban bepároljuk, és vékonyréteg GF kovasavgélen kromatografáljuk, 40 x 20 cm méretű lemezen. A kifejlesztő oldat etilacetát-n-butanol-víz 4:1:1 ará-40 nyú keverékének felső fázisa. Az Rf = 0,35-nél levő, ultraibolya sugarakat gyengén abszorbeáló sávot 50 : 50 arányú aoeton-víz eleggyel eluáljuk. Az eluátumot 4 ízben az eluátummal egyenlő térfogatú etilacetáttal extraháljuk. Az etil-45 aoetátos fázist vákuumban szárazra bepárolva kristályos ösztriol-glukozidot kapunk. Ezt több ízben metanol-etilacetát elegyből átkristályosítva kb. 10 mg tiszta*ösztriol-Í6a-(a-D-glukozidot) kapunk 255—257° olvadásponttal; Ta]23 D *= +143° 50 (metanolban). lr 281 ny* (£ = 2190), 286 mu (e = 2000); v £f£ 3485, 3360, 1604, 1575, 1498 cm""1 . összetétel: 55 számított: C 64,00, H 7,57% talált: C 64,24, H 7,70% Oldhatóság vízben: 0,13 mg/ml. A termék az I képletű vegyület. 60 •>
