160154. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-)-(cisz-1,2-epoxipropil)-foszfonsav előállítására

160154 6 hajthatjuk végre. Optimális eredmények elérése céljaiból a fermentálást előnyösen 26—30 C°-on végezzük. A Stneptomyces törzs tenyésztésére és az antibiotikum termelésére alkalmas közeg pH-ja kb. 5—9 közötti érték lehet, előnyösen azon- ,5 ban kb. 6,0—7,5 pH-jú közegben dolgozunk. A találmány szerinti eljárás megvalósítása során először valamely (-)-(cisz-l,2-epoxipropil)-f oszfonsav-termelő mikroorganizmus ferde agar- io tenyészetéhez steril táptalajt adunk, és így sejtszuszpenziót állítunk elő. Ezután a ferde tenyészettel egy oltólombikot beoltunk, és az oltólombikot jó növekedés eléréséig, kb, 1—3 napig kb. 28 C°-on rázatjuk. Az oitólombik tartalmát hasz- 15 náljuk fel a reaktor-lombikok beolt ására. Eljárhatunk úgy is, hogy az oltólombikot nem ferde tenyészettel, hanem liofilizált tenyészettel, vagy fagyasztott inokulummal oltjuk be. 20 Az oltás során 30 ml reakcióközeghez általában 1 ml oltóanyagot használunk fel. Az elegyhez ezután megfelelő mennyiségű kobaltot adunk, és a. fermentációt 2—4 napig végezzük, miközben a táptalajt keverjük és/vagy levegőztetjük, és a 25 hőmérsékletet kb. 28 C°-on tartjuk. Az összes reakciólombik (azaz a kobaltot tartalmazó, és a kontroli-lombikok) tartalmát ezután vizsgálatnak vetjük alá, és meghatározzuk az egyes lombikokban képződött antibiotikum mennyiségét. 30 A (-)-(cisz^l,2-epoxipropil)-foszfionsav kimutatását általában lemezkorongos eljárással végezzük, teszt-organizmusként Proteus vulgaris MB —838-at (ATCC 21100. NRRL B—3361) alkalma- 35 zunk. A reszt^org'anizmusból 0,2% élesztőkivonatot (Difco) tartalmazó tápagaron (Difco) ferde tenyészetet állítunk elő. A beoltott ferde tenyészeteket 18—>24 órán át 37 C°-on inlkubáljuk. A tenyészeteket egy hétig hűtőszekrényben tárol- 40 hatjuk, hetenként friss tenyészetet készítünk. A vizsgálathoz szükséges inokulumokat naponta frissen készítjük. Az inokulum előállítása során 0,2% élesztőkivonatat (Difco) tartalmazó 50 45 ml táptalajt (Difco) 25'0 ml-es Erlenmeyer lombikba töltünk, és a lombik tartalmát a ferde tenyészet kaparékával beoltjuk. A fermentlé sűrűségét 0,2%-os élesztőkivonat-oldattal úgy állítjuk be, hogy fény átbocsátó-képessége 660 ra/j, hullám 50 hossznál 40% legyen (a méréshez Bausch & Lomb Spectronic 20 készüléket használunk). Vakpróbaként beoltatlan táptalajt alkalmazunk. 1 liter közeget 30 ml, a fenti módon hígított fermentlével oltunk be. 55 Vizsgálati közegként 0,2% élesztőkivonatot (Difco) tartalmazó tápagart (Difco) használunk fel. A közeget elkészítés után autoklávban sterilizáljuk, és 50 C°-<ra hagyjuk lehűlni- Ezután a go közeget beoltjuk. 10 ml-t steril Petri-csészébe töltünk, és megszilárdulni hagyjuk. Az aktivitást egységekben fejezzük ki. Egy egység olyan ml-kénti antibiotikum-tartalomnak 65 felel meg, amely egy 12,7 mm-es papírkorongon 28 mm átmérőjű zónát képez. A standard görbe felvételéhez négyféle koncentrációjú antibiotikum-oldatot használunk fel, azaz 0,3, 0,4, 06 és 0,8 egység/ml koncentrációjú oldatokat. Az oldatokat úgy készítettünk, hogy az antibiotikumot 8,0 pH-jú, 0,105 mólos trisz-{hidiroximetiil-amíino-' metán pufferrel hígítottuk. A standard görbe felvételéhez öt lemezt használtunk fel, és minden lemezre négy korongot helyeztünk; :az egyes korongokra felvitt antibiotikum koncentrációja a fenti négy érték volt. A lemezeket 18 órán át 37 C°-on inkubáltuk, és megmértük a gátlási zónák átmérőjét. Az átmérőket mm-ben adjuk meg. Minden antibiotikum-koncentrációra kiszámítottuk az átlagos zónaátmérőt, és féllogaritmikus skálájú papíron felvettük a standard görbét. A kapott egyenes meredeksége 4 és 5 közötti érték. A reakciólombikok tartalmának vizsgálata során a mintát 8-as pH-jú, 0,05 mólos pufferoldattal megfelelő koncentrációjúra hígítottuk. Tesztorganizmusként Proteus vulgaris MB—838-at alkalmaztunk, és a vizsgálatot 0,2% élesztőkivonatot tartalmazó tápagarban végeztük. A vizsgálatot korongos vagy hengeres módszerrel végeztük, és a lemezekre 10—15 ml táptalajt öntöttünk. A korongos módszer esetében a korongokat 0,4 egység/ml-es antibiotikum oldatba merítettük, és a mintával szemközti oldalon helyeztük el a lemezen. A lemezeket 18 órán át 37 C°-on inkubáltuk, és meghatároztuk a zónák átmérőjét. Az átmérők nagyságát mm-ben adtuk meg. A hengeres módszer esetében lemezenként 6 hengert használtunk fel; 3 henger a mintát, és 3 henger a kontroli-oldatot tartalmazta, és a hengereket váltakozva helyeztük a lemezre. A kontrolloldat 1 y/ml mennyiségű szabad savat tartalmaz. öt standard lemezt használtunk fel, amelyek 0,25y/ml-től 3,0y/ml-ig terjedő, hatféle standard koncentrációt tartalmaztak. A kiértékelést nomogram segítségével végeztük, és az eredményeket egységekben, vagy y/ml-ben fejeztük ki. Egy egység szalbad sav 2,8 y^nak felel meg. Az antibiotikumot többféleképpen tisztíthat- , juk, ül. a tiszta állapotban való előállításra is több módszer ismeretes. Az egyik eljárás szerint az antibiotikumot alumíniumoxidon adszorbeáljuk; erre a célra mind bázikus, mind savval kimosott aluminiumoxidot alkalmazhatunk. Az adszorbeált antibiotikumot az alumíniumoxidról általában kb. 11,2-es pH-j ú, • vizes vagy vizes-alkoholos ammóniumhidroxid-oldattal oldjuk le, és az eluátumot frakciónként gyűjtjük össze. A (-)-(cisz-1,2-epoxipropil)-foszfonsav ammóniumsóját tartalmazó, szennyezett szilárd frakciókat a következőképpen tisztíthatjuk: a frakciókat metanolban oldjuk, az oldathoz azonos térfogatú n-butanolt adunk, a metanolt lepároljuk, a butanolban oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a tisztított antibiotikum-ammóniumsót tartalmazó butanolos oldatot elkülönítjük. Ha a butanolos oldatot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, szilárd ammónium-sót kapunk. Egy másik eljárásválto-3