160154. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-)-(cisz-1,2-epoxipropil)-foszfonsav előállítására

3 Merck & Co. Inc., Rah way, New Jersey cég tenyészet-gyűjteményében az MA—2898 számmal jelöltünk; a fenti törzstenyészetből elkülönített további mikroorganizmusok az MA—2911, MA— —2912 és MA—2913 jelölést kapták. Ezeket a tenyészeteket a Northern Utilization Research & Development Branch of the United States Department of Agriculture at Peoria, Illinois intézetben helyeztük letétbe; a letétbe helyezett mikroorganizmusok megjelölése NRRL B—3357, NRRL B—3358, NRRL B—3359 ill. NRRL B— —3360. Ezek a mikroorganizmusok a Streptomyces fradiae fajhoz tartoznak. Az antibiotikum egyéb Streptomyces-fajok szabályozott körülmények között végrehajtott tenyésztése során is képződik. A Streptomycas viridoehromogenes fajhoz tartozó, ugyancsak talajból izolált tenyészeteket a Merck & Co. Inc cég tenyészet-gyűjteményében az MA—2867, MA— —2903, MA—2916, MA—2917, MA—3270, MA— —3272 és MA—3267 számokkal jelöltük. Az MA—2903, MA—2867, MA—2916, MA—2917 és MA—3270 jelölésű mikroorganizmus-tenyészeteket a Northern Utilization Research & Development Division of the United States Department of Agriculture intézetnél helyeztük letétbe, és ott az NRRL—3413, NRRL—3414, NRRL—3415, NRRL—,3416, ill. NRRL—3427 megjelölést kapták. Az MA—3269 megjelölésű tenyészet a Streptomyces wedmorensis fajhoz tartozik, letéti száma: NRRL—3426. Annak ellenére, hogy a leírásban csak három mikroorganizmus-fajt ismertetünk, az antibiotikum termelésére egyéb mikroorganizmus-fajokat, így a Streptomyces-törzsbe tartozó, természetben előforduló mikroorganizmusokat, vagy azok mutánsait, pl. a természetes kiválasztódással, vagy a mutagen szerek, mint Röntgen-sugárzás, ultraibolya-sugárzás, nitrogén-mustár, vagy hasonló anyagok hatására képződött mutánsokat is felhasználhatjuk . Tekintettel arra, hogy a tiszta (-)-(cisz-l,2-epoxipropil)-foszfansavat a fermentlében jelenlévő nagymennyiségű szennyezéstől rendkívül nehéz elkülöníteni, igen nagy jelentősége van az olyan eljárásváltozatnak, amellyel az antibiotikumnak a fermentlé szilárd anyag-tartalmához viszonyított koncentrációja megnövelhető. Azt találtuk, hogy ha a komplex szerves, ill. kémiailag meghatározott táptalajokhoz kobaltot adunk, a (-)-(cisz-l,2-epoxipropil)-foszfonsav nagyobb mennyiségben képződik. A „komplex szerves táptalaj" megjelölésen olyan közegeket értünk, amelyekben egyes alkotórészek nincsenek kémiailag meghatározva. Ilyen közeg pl. a különböző zabféleségeket, szójabablisztet, nátriumcitrátot, poliglikolt és oldható cefrét tartalmazó táptalaj. A „kémiailag meghatározott táptalaj" megjelölése azokra a közegekre vonatkozik, amelyek valamennyi alkotórésze kémiailag meghatározott. Ilyen közeg pl. a kukoricakeményítőt, savanyú 4 káliumfoszfátot, nátriumcitrátot, aszparagint, methionint, mononátriumglutamátot, kalciumkloridot, magnéziumszulfátot és ferriszulf átot tartalmazó táptalaj. Az antibiotikum termelésének 5 megnöveléséhez szükséges kobalt mennyisége a felhasznált táptalajtól függően változik. Még a 0,Í125 g/l mennyiségű kobaltot tartalmazó .táptalajokban is képződik bizonyos mennyiségű antibiotikum, azt tapasztaltuk azonban, hogy jó ho-10 zam eléréséhez előnyösen kb. 0,0010 — kb. 0,075 g/l mennyiségű kobaltot tartalmazó táptalajt kell alkalmaznunk. Ha komplex szerves táptalajt tartalmazó közeghez kb. 0,0025 g/l — 0,075 g/l mennyiségű kobaltot adunk, a (-)-(cisz-l,2~epoxi-15 -propil)-foszfomsav termelése 36%-kal növekszik. Ha ezekhez a közegekhez nagyobb mennyiségű kobaltot adunk, az antibiotikum termelése csökken. Más részről azt tapasztaltuk, hogy a kémiailag meghatározott, vagy a szintetikus köze-20 gekban a (-)-(cisz-l,2-epoxipropil)-foszfoinsav termelését > 2/íg/ml — 27 fig/raí mennyiségű kobalt növeli. A kobaltot fém formájában is adhatjuk a táp-25 talajhoz, előnyösebben azonban kobaltvegyület, célszerűen kobaltsó, pl. kobaltnitrát, kobaltklorid vagy kobaltszulfát formájában mérjük be. A kobaltot továbbá valamely természetben előforduló kobaltsó vagy kobaltkomplex formájában is a 30 táptalajba juttathatjuk, így pl. a táptalaj kobaltban dús alkotórészeket is tartalmazhat. A szokásos táptalajok asszimilálható szénforrásit, asszimilálható nitrogénforrást, szervetlen sókat, és szükség esetén növekedést elősegítő anyagokat 35 tartalmaznak. Az új antibiotikumot a találmány szerint mind felszíni, mind szubmerz tenyészetben előállíthatjuk, előnyösen azonban szubmerz állapotban vé-40 gezzük a fermentálást. Kismennyiségű anyagok fermentálása esetén általában úgy járunk el, hogy a megfelelő táptalajmennyiséget üvegekbe töltjük, a megtöltött üvegeket 120 C°-ra hevítve sterilizáljuk, az üvegeket valamely, (-)-(cisz-l,2-45 -epoxipropil)-foszfonsavat termelő Streptomyces törzs spóráival,"* vagy vegetatív sejttenyészetével beoltjuk, az üvegek nyakát vattával lazán bedugaszoljuk, és a fermentációt állandó, kb. 28 C° hőmérsékletű helyiségben, rázógépen 3—5 napig 50 végezzük. Nagyobb mennyiségek esetén a fermentálást célszerűen keverővel és levegőztető berendezéssel felszerelt reaktorban végezzük. Ebben az esetben a táptalajt a reaktorban állítjuk össze, és 120 C°-ra hevítve sterilizáljuk. A steril 55 közeget lehűtés után valamely megfelelő Streptomyces törzs vegetatív sejttenyészetével oltjuk be, és a fermentálást 2—4 napig végezzük, miközben a táptalajt keverjük és/vagy levegőztetjük, és a hőmérsékletet kb. 28 C°-on tartjuk. Ezt az eljárásmódot előnyösen akkor alkalmazzuk, ha nagymennyiségű (-)-(cisz-l ,2-epoxipropil)-foszfonsavat kívánunk előállítani. A (-)-(eiBz-l,2-epoxipropil)^foszfonsavat termelő mikroorganizmusok felhasználásával végzett fi5 fermentálást kb. 20—40- C°-os hőmérsékleten 2