160109. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lipáz előállítására

'190109 A kisózásból eredő hátrányokat főleg az anorganikus szennyezések szempontjából csökkenti a szerves oldószeres kiesapás. A 661150 sz. holland szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint a fermentléből acetonnal csapják ki a lipázt, más esetben [Appl. Microbiol., 15, 292 (1967)] alkoholt használnak e célra. Hasnyálmirigy vizes kivonatából is ugyanezen oldószerek egyikével csapják ki a lipázt, de proteázzal és amilázzal együtt [British Pharmacopoeia, p. 704 (1968; 3 223 594 sz. USA szabadalmi leírás]. Az ilyen típusú eljárásnak azonban nagy a térfogat- és a szerves oldószer igénye, mert a lipáz kicsapásához a kivonat vagy a fermentlé mennyiségével legalább megegyező, de inkább 2—3-<szoros térfogatú kicsapószer szükséges. Az oldószer-térfogat igényt előnyösen befolyásolja az a megoldás, amelynél a fermentlevet kiesapás előtt bepárolják [Bull. Soc. Chim. Biol., 48, 747 (1966)]. A 6495 sz. japán szabadalmi leírásban ismertetett eljárás ugyancsák kíméletes bepárlást alkalmaz és 4 térfogat alkohollal kicsapva nyeri az enzimet. E megoldás haladást jelentett főleg a fermentációs eredetű lipáz kinyerésének módozataiban, az ipari megvalósításban azonban továbbra is fennmaradtak a nem elhanyagolható problémák, elsősorban az, hogy a bepárláson alapuló enzimbetöményítés energiaigényes folyamat, és a hőkezelés miatt a lipáz esetén csak különlegesen kíméletes körülmények között végezhető el; emellett a bepárlás hő- és vákuum igénye, kihatása az enzim visszanyerésére törzsenként, sőt fermentlevenként — azok összetételétől függően — változik. Még bizonytalanabb e módszer eredményessége hasnyálmirigy eredetű lipáz esetén, amely a vizes és a zsírfázis között a kezelés körülményeitől függően oszlik meg [Biophys. Biochim. Acta, 24, 425 (1957)]. Maga a szerves oldószeres kicsapás pedig nem képes különbséget tenni fehérje és poliszacharid molekulák között; ennélfogva a szerves oldószeres kicsapással nyert termék főleg szénhidrát-jellegű ballasztanyagokkal szennyezett. A fehérjék és így az enzimek betöményesítésére lehetőséget nyújt a vízoldható makromolekulákkal, így polianionokkal való kicsapás is. Mint ilyen, a természetes polianiolok közül ismert a tannin vagy a lignin. Willstätter és Pollinger [Liebigs Annalen der Ghemie, 430, 269 (1923)] írta le először, hogy a torma vizes kivonatához adott tannin oldat csapadék-kiválást okoz, amely csapadék ecetsavas alkoholban oldódik és ebből az oldatból peroxidáz enzim nyerhető ki kaolinon történő megkötés révén. A 629 416 sz. német szabadalmi leírás szerinti eljárás alkalmazott később tanninos kiesapást amiláz előállítására úgy, hogy a nyert csapadékot acetonnal extrahálták és a maradékból vízzel oldották ki az enzimet. Egy másik megoldásban a tanninos csapadék acetonnal végzett alapos extrakciója után ugyanezzel az oldószerrel száraz port állítanak elő, amelyből aztán víz-10 15 20 25 30 40 45 50 55 60 65 zel vagy híg vizes puffer oldattal oldják ki a fermentációs úton termelt proteázt [Europ. J. Biochem., 6, 425 (1968) vagy cellulázt (Methods in Enzymology, 8, 604 (1966)] vagy amilázt (629 416 sz. német szabadalmi leírás). E módszer továbbfejlesztése jelenti a 6 612 046 *z. holland szabadalmi bejelentés, mely szerint az aszpergillopeptidáz^aktivitású fermentlevet tanninnal vagy ligninnel kicsapják, a kicsapott enzimet vízben oldják, majd ioncserélőn adszorbeálják. Kétségtelen, hogy ezekben az eljárásokban a tanninos kicsapás a fermentlé szerves anyagainak betöményítését eredményezi, de sem a kicsapás^ sem az említett beoldási módok nem biztosítják az enzimeknek a ballasztanyagoktól való elválasztását, és még kevésbé érhető el, hogy a kicsapott fehérjék között valamilyen szelekció érvényesüljön [J. Polym. Sei., 12, 317 (1954)]. Ezen javít az 1 224 255 sz, német szabadalmi leírás szerinti eljárás azzal, hogy a tanninos csapadékot először 30—50% acetont, alkoholt, ill. glikolt tartalmazó vízzel extrahálja, és csak ezután csapja ki az enzimet az oldószer-koncentráció növelésével. Ezt a módszert egyaránt alkalmasnak találták cellulóznak és proteáznak fermentléből, valamint proteáznak hasnyálmirigyből való előállítására. Az 1 225 584 sz. német szabadalmi leírás szerint pH 2,0—5,0 vegyhatású közegben hozzák össze az amiloglükozidázt tartalmazó fermentlevet tanninnal és a kicsapott anyagot elkülönítik. Meibaum [Nature, 184, 1799 (1959)] pH 4,7-re állított közegből csapja ki a lizozimet és az aldolázt. Az 1 224 255 sz. német szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint pH 5,8-ra állított fermentléhez ammóniumszulfátot és tannint adnak és így állítják elő a gomibaproteázt és cellulózt. Ezekkel az adatokkal egybehangzóan tejfehérjék is pH 4,8—5,2 között csapódnak ki tanninnal [Aroh. Pharm., 299, 763 (1966)], ecetsavas pH-beállítás után. A találmány célja nagyüzemi méretben könnyen megvalósítható olyan eljárás biztosítása, amely kiküszöböli a már ismert eljárások hátrányait és lehetővé teszi terápiás és élelmi-Fzeripari célra alkalmas tisztaságú lipáz előállítását. Kísérleteink során azt a meglepő felismerést tettük, hogy fermentációs közegből vagy állati eredetű szerkivonatból tanninnal a lipáz reverzibilisen csapható ki, ha a kicsapásnál a közeg vegyhatását pH 6,0 és 7,5 között tartjuk, az enzim kivonásához 0,5—3,0 M piridint tartalmazó vizes oldatot használunk, és a tannin és a kísérő ballasztanyagok elkülönítését pH .5,5 és 7,5 között végezzük. A lipáz előállításának ez a módja azért meglepő, mert nem ismeretes, hogy neutrális vegyhatású közegben vagy ennek közvetlen közelében enzim vízoldhatatlan vegyületet képezne tanninnal és így az oldatból az enzim elkülöníthető lenne. Arra, hogy a lipáz a tanninos