160109. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lipáz előállítására
5 kicsapásnál ilyen különleges pTi-viszonyokat igényel, sem" a 'liipáz ismert tulajdonságaiból, sem a tanninos kicsapásra vonatkozó ismeretanyagból heirilehet Tcövetkeztetni. A különböző eredetű lipázok stabilitása pH 4 felett (pH 8-ig) 5 lényegében azonos [Bull. Soe1. Ghim. Bíol., ; 4S, 747 (1966)]; 1300 487 sz. német, 268 515 sz. osztrák, 1230.751 sz, német és 1440497 sz. francia szabadalmi leírás; Így nem'volt várható, hojgy a neutrálishoz közeli vegyhatás mellett a io lipáz á kezelés körülményeit jobban fogja elviselni, mint pH 6 alatti közegben. Az eddig vizsgált lipázok izoelektromos pontja sem tér él általában az olyan fehérjéktől, amelyek, tänninnal ismerten. savas pH-tartományban csapba- 15 tók ki. A* tannin Myrbäck vizsgálata szerint [Arikiv. Kemii Mineral. Geol, 24A, 11 (1946)] a pikrinsavhoz hasonlóan a fehérjék aminoesoportjával sót képez, e csoportok viszont savas pH-tartományban disszoeiálódnak olyan mér- 20 tékben, hogy a reakció létre tudjon jönni. E megoldás alapján meglepő, hogy a lipáz más enzimekhez képest magasabb pH-értékeknél csapható ki reverzipilísen, éspedig jóval az izoelektromos pontja felett (pl. a pankreász 2s lipáz izoelektromos pontja pH 5,25 [Biophys. Biochim. Acta, 23, 264 (1957)]. A lipázok kémiai; összetételéről jelenleg rendelkezésre álló adatok alapján is meglepő a 30 tanninos kicsapás eljárásunk szerinti módja. „A lipáz azzal a különleges sajátsággal rendelkezik, hogy erősen kötődik bizonyos apoláris komponensekhez, mint a tristearin vagy a stearinsay'f , állapítja meg Desnuelle [Adv. in Enzymol., 23, „5 135 (1961)]. Wilstätter és a Desnuelle-iskola vizsgálataiból ismeretes, hogy a lipáz triglicerid-emulzióval, és zsírsavakkal különleges komplexet képez, melynek egyensúlya a közeg változásaira érzékenyen reagál, és megbomlása könnyen az enzimaktivitás elvesztéséhez vezet [Z. Physiol Chem., 125, 93 (1923) Biophys. Biochim. Acta, 24, 425 (1"9S7)]. A lipáz fermentáció viszonyai között, ahol különböző zsírok és zsírsavak feltétlenül jelen vannak és az enzim stabilitását növelik [Proc. 19th Symposium in Enzyme Chem., p. 180, (1968)], méginkább a zsírtartalmú hasnyálmirigy^kivonat esetén számolni kell ilyen lipáz-lipoid komplex képződéssel [Biophys. Biochim. Acta 105, 600 (1965VJ, ami azt jelenti, hogy a lipáz a feldolgozásra kerülő egyéb hidrolitikus enzimekhez képest eltérő fizikokémiai állapotban van jelen. Ehhez hozzájárul az az újabb megállapítás, hogy a lipáz molekulához sok szénhidrátot tartalmazó komponens van kötve [Biophys. Biochim. Acta, 191, 598 (1969); J. Dairy Sei., 47, 1167 (1964)]. Ennélfogva a lipáz — szemben a fentemlített enzimekkel — szerkezetéből adódóan glikoproteidnek tekintendő. Mind a lipáz~lipoid4:omiplex kialakulása, mind a glikoproteid szerkezeti jelleg a lipáz fizikokémiai viselkedését annyira megváltoztatja, hogy a kicsapószerekkel szembeni viselkedés az egyszerű fehérjékhez 'képest mélyrehatóan mó- 65 6* dósul. Erre mutat az a tény, hogy' a glikoproteidek 'anionos szerves kicsapószerekkel,' így triklóreeetsavval vagy szulfoszalicilsavyal meglepő módon nem csapódnak ki, és éppen ezen az alapon választhatók el egyéb fehérjéktől [J. Biol. Chem., 181/ 499 (1949); J; áiol. Chem., 208, 669 (1.954); J. Am.. Oheni. Soc. 75, 60 (1953)].. ':: ;';.' :! '.' ' E tulajdonságai alapján tehát árra lehetett következtetni, hogy a lipáz egy rhásik ánionqs kies apószerrel, például tanninnal seilt csapható ki, vagy/legalábbis a kicsapás reverzibilitása nem áll fenn. / ' Ezzel, összhangban egyetlen utalás seni található a szakirodalomban arra, hogy valamelyik lipo- vagy glikoproteid tanninos kicsapásra alapozottan lett volna előállítható,' de :már említett ismert, tannint alkalmazó; eljárások kapcsán sem . tesznek említést arról, hogy' azok lipázra is alkalmazhatók lennének. Megvizsgáltuk a lipáz előállítását az említett módszerekkel, de azok egybehangzóan nem vezettek érdemleges lipáz^aktivitású készítményhez. { Mivel a glikoproteidek tanninos kicsapása az irodalomban teljesen ismeretlen, megvizsgáltuk néhány ismeretlen glikoproteid kicsaphatóságát tanninnal. Megállapítottuk, hogy az ovomucoid vagy a kazein tanninnal csak pH 4,5 alatt csapódik ki, ahol azonban a savas közeg önmagáiban is hajlamosítja ezeket a fehérjéket a kicsapódásra. Ennélfogva nemcsak az jelent új felismerést, hogy a fermentlében vagy a szervkivonatban összetett fehérjeként jelenlevő lipáz tanninnal kicsapható, hanem az is, hogy nem a kémiai felépítésénél fogva várható, hanem ennél jóval magasabb — még az egyszerű fehérjék kicsapásához szükségest is meghaladó — pH-tartományban csapható ki. Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy ha a fentebbi felismerés szerinti módon tanninnal kicsapott anyagot más enzimekre már ismert megoldással, így vízzel vagy vizes alkohollal vagy acetonnal extraháljuk, csak igen alacsony aktivitású lipázt nyerünk; hasonló a helyzet, ha az extrakciót sóoldatokkal, szokásos puffercldatokkal, vagy a piridin 0,5 M-t meg nem haladó koncentrációjú oldatával végezzük. Ezzel szemben a kivonatba magas hatóértékű lipázt sikerül átvinni, ha piridinből legalább 0,5 M, előnyösen 0,8—1,5 M mennyiséget alkalmazunk, és az oldatlan anyagok leválasztásánál a közeg vegyihatását szervetlen savval, vagy könynyű fémek erős szervetlen savval képezett sójával pH 5,5—7,5 értékre állítjuk. E felismerésiben az meglepő, hogy a lipáz hatékony óldatbaviteléhez piridin szükséges, és azt sem ammónia, sem egyéb szerves amin-bázisok, sem vízzel elegyedő szerves oldószerek helyettesíteni nem tudják. Nem kevésbé meglepő, hogy a tanninos csapadók megbontása ilyen magas koncentrációjú piridiout igényel, amilyet általában enzimek előállításánál nem használnak. Figyelemre méltó továbbá az is, hogy az elució kö-3
