159842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolizokináz előállítására mikroorganizmusokból
3 nádcukorral. Glikokoll helyett más nitrogénforrás, — így pl. alanin, etilamin vagy lizin — is alkalmazható. A szén- és nitrogénforrás, valamint a sók koncentrációi széles határok között mozoghatnak. FeC04 és CaC0 3 és MgS0 4 5 teljesen el is hagyható. 1 literes Erlenmeyer-lombikot megtoltunk pl. 100 ml tápoldattal, ismert módon sterilizáljuk, majd a vizsgálandó törzzsel beoltjuk és rázógépen 15—35 °C-on, előnyösen 23—30 °C-on io tenyésztjük. Amennyiben a tenyészet növekedést mutat — ami általában 1—10 nap után,. de legtöbbször már 3—5 nap után bekövetkezik —, mintát veszünk, pl. 5 ml-t, ebből a mintából szűréssel vagy centrifugálással a mice- 15 liumot leválasztjuk és 0,1 n HCl-al az oldat pH értékét 0—4 közé állítjuk be. Ezután 15 perc alatt 65°-ra melegítjük, majd azonnal lehűtjük és 0,1 n NaOH-al a pH értéket kb. 5— 10 közé állítjuk. A fibrinolizokináz-aktivitást 20 a szokásos módon Müllertz—Astrup-lemezen határozzuk meg. Az esetleg még visszamaradó proteolitikus aktivitást — ugyancsak az ismert módon — a melegített Müllertz—Astrup-lemezen határozzuk meg. 25 A fent leírt módon vizsgáltuk meg a sugárgomba-félék rendjéhez tartozó különböző fajták számos törzsét és a különböző fajtáknál — ha részben gyengén is — de kifejezett lizokináz-aktivitást találtunk. A termelés és a te- so nyészthetőség szempontjából a legelőnyösebbek voltak a streptomyces családhoz tartozó törzsek, különösen a streptomyces fajták. A vizsgált 32 sztreptomicéta közül 16 sztreptomicéta tenyészoldata nem melegített fibrinlemezen 35 lebontási zónákat mutatott még akkor is, amikor a tenyészoldat pH-értékét 1,5—1,8-ra állítottuk be. Ezen 16 törzs közül 6 melegített lemezen — vagyis denaturált plazminogénnel — nem mutatott lebontási zónákat, tehát a 40 lezajlott kezelés után nem tartalmazott proteázokat. Ezekben az esetekben tehát a hatást egy lizokináznak kell tulajdonítani. Ez a 6 törzs (leírást lásd 1. táblázat) — mely . sporofór szerkezetét tekintve a Streptomyces fajták közé tartozik — az 1. táblázatban megadott fontosabb rendszertani jellemzőket mutatja (Hütter, R., „Systematik der Streptomyceten", Bibliotheca Microbiologica, Fasc. 6, S. Karger, Basel, New York, 1967). 50 Az St 16, St 18 és St 24 jelű törzseket a Centralbureau voor Schimmelcultures-nál, CBS 670.68, 671.68 és 669.68 szám alatt letétbe helyeztük. 55 Ezeket a törzseket a fibrinolizokináz előállítására a fent leírt módon tenyésztjük. 2—3 napos növekedés után a micéliumot leválasztjuk és a tápoldatból, a már ismert módon, az oldat betöményítésével és szerves oldószerrel való kicsapással kapjuk a lizokinázt. A kapott fibrinolizokinázt gyógyszerként használjuk ismert esetekben. A felhasználás és az adagolás irodalma: Fletcher és tsai, J. Lab. and Clin. Med. 65, 713 (1965). 65 4 •1. példa: 1 literes Erlenmeyer-lombikba bemérünk 100 ml 2% glicerin, 0,25% glikokoll, 0,04% kukoricalekvár, 0,4% szójaliszt, 0,1% NaCl, 0,1% K2 HP0 4 , 0,01% MgS0 4 -7 H 2 0, 0,01% FeS0 4 •7 H2 0 és 0,01% CaC0 3 összetételű tápoldatot (60 percig 120 °C-on sterilizálva), majd beoltjuk 1 ml spóraszuszpenzióval, melyet az St 16 törzs Plotho szerint glicerin-glikokoll-agárral készített 10 napos ferde-agár tenyészete 12 ml vízzel való leöblítésével kapunk. A kultúrát 24 °C-on, rázógépen tenyésztjük. Három napi tenyésztés után olyan tenyészoldatot kapunk, mely 1,9 CTA-egység/ml-t tartalmaz. A közel tiszta centrifugált oldatot pl. 1,5 pH-ra állítjuk be és 15 percig 65 °C-on tartjuk. Az ezt követő gyors lehűtés után a pH-t 7,5-re állítjuk be és az oldatot újból centrifugáljuk. Az üledéket eldobjuk. A centrifugálásnál nyert oldatot négyszeres térfogatú —20 °C-ra hűtött acetonba öntjük. 5 percig keverjük, majd a keveréket +4 °C-on három óra hosszat tartjuk.. Az oldatot dekantálás után elöntjük. Az "üledéket ismételten hideg száraz acetonban felvesszük és ebben alaposan diszpergáljuk, majd centrifugáljuk és a kapott üledéket vákuumban szárítjuk. Termelés kb. 50—80%. Dúsítás kb. tízszeres; fajlagos aktivitás: 5 CTA/mg. Az St 16 törzs az 1., 2. és 3. táblázatban megadott fajtajellegzetességet mutatja és Streptomyces ohrysomallus Lindenbein-nek tekinthető [Lindenbein, W., Arch. Mikrobiol. 17, 361 (1952)]. A CTA egység definicója S. Sherry és munkatársai „Assay of urokinase preparations with the synthetic substrate acetyl-L-lysine methyl ester" c. cikkében (J. Lab. Clin. Med., 64, 145 (1964)] található. A 146. oldal utolsó bekezdésének fordítása szerint „a CTA egység az Országos Kardiológiai Intézet Trombolitikus Hatóanyagok Bizottsága által újabban elfogadott standard urokináz egység", amelyet fibrinolitikus vizsgálattal mérnek. Egy CTA egység fibrinolitikus meghatározás alapján közel egyenértékű 2 Abbott-, 12 Sterling-Winthrop- vagy 0,7 Ploug-egységgel. A „fibrinolitikus vizsgálatot" Astrup és Müllertz ismertetik „Klinische Methoden der Blutgerinnungsanalyse" c. könyvük [G. Thieme Verlag, Stuttgart (1959)] 244. oldalán. 2. példa: Az 1. példa szerinti tápoldatot beoltjuk 1 ml spóraszuszpenzióval, melyet az St 24 törzs 10 napos ferde-agár tenyészete 12 ml vízzel való leöblítésével kapunk és az 1. példában megadott módon tenyésztjük. Kétnapos tenyésztéssel olyan tenyészoldatot kapunk, mely 0,51 CTA-egység/ml-t tartalmaz. 2