159842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolizokináz előállítására mikroorganizmusokból

3 nádcukorral. Glikokoll helyett más nitrogén­forrás, — így pl. alanin, etilamin vagy lizin — is alkalmazható. A szén- és nitrogénforrás, valamint a sók koncentrációi széles határok között mozoghatnak. FeC04 és CaC0 3 és MgS0 4 5 teljesen el is hagyható. 1 literes Erlenmeyer-lombikot megtoltunk pl. 100 ml tápoldattal, ismert módon sterilizáljuk, majd a vizsgálandó törzzsel beoltjuk és rázó­gépen 15—35 °C-on, előnyösen 23—30 °C-on io tenyésztjük. Amennyiben a tenyészet növeke­dést mutat — ami általában 1—10 nap után,. de legtöbbször már 3—5 nap után bekövetke­zik —, mintát veszünk, pl. 5 ml-t, ebből a min­tából szűréssel vagy centrifugálással a mice- 15 liumot leválasztjuk és 0,1 n HCl-al az oldat pH értékét 0—4 közé állítjuk be. Ezután 15 perc alatt 65°-ra melegítjük, majd azonnal le­hűtjük és 0,1 n NaOH-al a pH értéket kb. 5— 10 közé állítjuk. A fibrinolizokináz-aktivitást 20 a szokásos módon Müllertz—Astrup-lemezen határozzuk meg. Az esetleg még visszamaradó proteolitikus aktivitást — ugyancsak az ismert módon — a melegített Müllertz—Astrup-leme­zen határozzuk meg. 25 A fent leírt módon vizsgáltuk meg a sugár­gomba-félék rendjéhez tartozó különböző faj­ták számos törzsét és a különböző fajtáknál — ha részben gyengén is — de kifejezett lizo­kináz-aktivitást találtunk. A termelés és a te- so nyészthetőség szempontjából a legelőnyösebbek voltak a streptomyces családhoz tartozó tör­zsek, különösen a streptomyces fajták. A vizs­gált 32 sztreptomicéta közül 16 sztreptomicéta tenyészoldata nem melegített fibrinlemezen 35 lebontási zónákat mutatott még akkor is, ami­kor a tenyészoldat pH-értékét 1,5—1,8-ra ál­lítottuk be. Ezen 16 törzs közül 6 melegített lemezen — vagyis denaturált plazminogénnel — nem mutatott lebontási zónákat, tehát a 40 lezajlott kezelés után nem tartalmazott prote­ázokat. Ezekben az esetekben tehát a hatást egy lizokináznak kell tulajdonítani. Ez a 6 törzs (leírást lásd 1. táblázat) — mely . sporofór szerkezetét tekintve a Streptomyces fajták közé tartozik — az 1. táblázatban meg­adott fontosabb rendszertani jellemzőket mu­tatja (Hütter, R., „Systematik der Streptomy­ceten", Bibliotheca Microbiologica, Fasc. 6, S. Karger, Basel, New York, 1967). 50 Az St 16, St 18 és St 24 jelű törzseket a Centralbureau voor Schimmelcultures-nál, CBS 670.68, 671.68 és 669.68 szám alatt letétbe he­lyeztük. 55 Ezeket a törzseket a fibrinolizokináz előállí­tására a fent leírt módon tenyésztjük. 2—3 na­pos növekedés után a micéliumot leválasztjuk és a tápoldatból, a már ismert módon, az ol­dat betöményítésével és szerves oldószerrel való kicsapással kapjuk a lizokinázt. A kapott fibrinolizokinázt gyógyszerként használjuk ismert esetekben. A felhasználás és az adagolás irodalma: Fletcher és tsai, J. Lab. and Clin. Med. 65, 713 (1965). 65 4 •1. példa: 1 literes Erlenmeyer-lombikba bemérünk 100 ml 2% glicerin, 0,25% glikokoll, 0,04% kuko­ricalekvár, 0,4% szójaliszt, 0,1% NaCl, 0,1% K2 HP0 4 , 0,01% MgS0 4 -7 H 2 0, 0,01% FeS0 4 ­•7 H2 0 és 0,01% CaC0 3 összetételű tápoldatot (60 percig 120 °C-on sterilizálva), majd beolt­juk 1 ml spóraszuszpenzióval, melyet az St 16 törzs Plotho szerint glicerin-glikokoll-agárral készített 10 napos ferde-agár tenyészete 12 ml vízzel való leöblítésével kapunk. A kultúrát 24 °C-on, rázógépen tenyésztjük. Három napi te­nyésztés után olyan tenyészoldatot kapunk, mely 1,9 CTA-egység/ml-t tartalmaz. A közel tiszta centrifugált oldatot pl. 1,5 pH-ra állítjuk be és 15 percig 65 °C-on tartjuk. Az ezt kö­vető gyors lehűtés után a pH-t 7,5-re állítjuk be és az oldatot újból centrifugáljuk. Az üle­déket eldobjuk. A centrifugálásnál nyert olda­tot négyszeres térfogatú —20 °C-ra hűtött acetonba öntjük. 5 percig keverjük, majd a keveréket +4 °C-on három óra hosszat tart­juk.. Az oldatot dekantálás után elöntjük. Az "üledéket ismételten hideg száraz aceton­ban felvesszük és ebben alaposan diszpergál­juk, majd centrifugáljuk és a kapott üledéket vákuumban szárítjuk. Termelés kb. 50—80%. Dúsítás kb. tízszeres; fajlagos aktivitás: 5 CTA/mg. Az St 16 törzs az 1., 2. és 3. táblázatban megadott fajtajellegzetességet mutatja és Strep­tomyces ohrysomallus Lindenbein-nek tekint­hető [Lindenbein, W., Arch. Mikrobiol. 17, 361 (1952)]. A CTA egység definicója S. Sherry és mun­katársai „Assay of urokinase preparations with the synthetic substrate acetyl-L-lysine methyl ester" c. cikkében (J. Lab. Clin. Med., 64, 145 (1964)] található. A 146. oldal utolsó bekezdé­sének fordítása szerint „a CTA egység az Or­szágos Kardiológiai Intézet Trombolitikus Ható­anyagok Bizottsága által újabban elfogadott standard urokináz egység", amelyet fibrinoliti­kus vizsgálattal mérnek. Egy CTA egység fib­rinolitikus meghatározás alapján közel egyen­értékű 2 Abbott-, 12 Sterling-Winthrop- vagy 0,7 Ploug-egységgel. A „fibrinolitikus vizsgá­latot" Astrup és Müllertz ismertetik „Klinische Methoden der Blutgerinnungsanalyse" c. köny­vük [G. Thieme Verlag, Stuttgart (1959)] 244. oldalán. 2. példa: Az 1. példa szerinti tápoldatot beoltjuk 1 ml spóraszuszpenzióval, melyet az St 24 törzs 10 napos ferde-agár tenyészete 12 ml vízzel való leöblítésével kapunk és az 1. példában meg­adott módon tenyésztjük. Kétnapos tenyésztés­sel olyan tenyészoldatot kapunk, mely 0,51 CTA-egység/ml-t tartalmaz. 2

Next

/
Thumbnails
Contents