159840. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparigináz előállítására
159840 máznak. A kukoricalekvár e követelményekei; messzemenően kielégíti. Még jobb eredményeket érhetünk el, ha a kukoricalekvárban jelenlevő tejsav koncentrációját megnöveljük és pótlólag NHj<+) ionokat adunk hozzá. Tejsav helyett borostyánkősavat, fumársavat vagy L-almasavat is használhatunk. Escherichia coli által erjeszthető szénhidrátok (pl. glükóz, fruktóz, mannóz, maltóz, galaktóz stb.) vagy aminosavak, mint DL-valin, DL-szerin, L-cisztein, L-triptofán és DL-norvalin hozzáadása represzsziót okoz; L-glutaminsav, L-aszparaginsav, DL-alanin és glikokoll hozzáadása ezzel szemben az L-aszparagináz szintézisét elősegíti. Az élesztőkivonat szintén alapul szolgál ä találmány szerinti tápoldatokhoz. Jól használhatóknak bizonyultak a következő tápoldatok: 1. Kukoricalekvár (szárazanyag tartalomra vonatkoztatva) Nátriumlaktát (NH4 ) 2 S0 4 3,00% 0,60% 0,20% pH 7,0 2. Kukoricalekvár (szárazanyag tartalomra vonatkoztatva) Nátriumlaktát L-glutaminsavas Na glikokoll (NH4 ) 2 S0 4 3,OOu /o 0,30% 0,15% 0,15% 0,20% pH 7,0 3. Élesztőkivonat Nátriumlaktát (NH4 ) 2 S0 4 0,20% 1,00% 0,20% pH 7,0 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ezeket a tápoldatokat Escherichia coli ATCC 9637 ferde agar kultúrájával oltottuk be, és rázógépen rázva kb. 20 órán át 30 °C-on tenyésztettük. A kultúra pH-ja ez idő alatt 8,5— 8,9-re emelkedett. Azonos eredményeket értünk el ezeknek a munkafeltételeknek üzemi fermentációs léptékre való átvitele során is. A tenyésztés befejezése után egy 1000 feletti molekulasúlyú szerves bázist vagy annak sóját adjuk a kultúrához, miáltal a sejtek kicsapódnak és könnyen centrifugáihatókká válnak. A sejteket vízben újra felszuszpendáljuk, majd aceton hozzáadása révén ismét kicsapjuk. Eköz- 55 ben a sejteket feltárjuk, és úgy alakítjuk át, hogy a képződő L-aszparagináz a következő lépésben — amely többszöri centrifugálásból, többszöri felszuszpendálásból és vízzel történő extrakcióból áll — vízzel kivonható. Ebből a szuszpenzióból egy fent említett szerves bázisnak a hozzáadása által az extrahált sejteket, nuikkinsavakat és szennyező fehérjéket kicsapjuk, és centrifugálással eltávolítjuk. A csapadéktól elválasztott oldatból az L-aszparagináz 65 60 nagymennyiségű aceton hozzáadásával kicsapható. A sejtek feltárásához és az L-aszparagináz kicsapásához aceton helyett más, vízzel elegyedő vagy vízzel korlátoltan elegyedő szerves oldószert, mint metanolt, etanolt, izopropanolt, metiletilketont, dimetilszulfoxidot is használhatunk. Az eddig ismert eljárásokkal szemben az eljárás meglepő előnye az, hogy gyakorlatilag pirogénmentes állapotban szolgáltat L-aszparaginázt. Kultúra-oldatokból izolált baktériumsejtek relatív L-aszparagináz aktivitásának meghatározása 15,0 ml kultúra-oldatot lecentrifugálunk, és a csapadéktól elválasztott oldatot elöntjük. A baktériumsejteket 15,0 ml kétszer desztillált vízben felszuszpendáljuk, és az ily módon kapott szuszpenzió 3,0 ml-ét 12,0 ml kétszer desztillált vízzel hígítjuk, és 15,0 ml 1/10 mólos foszfát-pufferben készült 2%-os L-aszparagin oldattal elegyítjük pH 7-nél. Ezután 0,2 ml toluolt adunk hozzá. Az ily módon előállított reakcióelegyet, amely most 1% L-aszparagint és az eredeti kultúraoldatban jelenlevő baktérium-koncentráció 1/10-ét, ill. a 3. tápoldat esetében 1/6-át tartalmazza, gumidugóval lezárjuk és 3 órán át 30 °C-on rázzuk. A megadott idő eltelte után az elegyet 5 percig 100 °C-on tartjuk, ismét lehűtjük, és tisztára centrifugáljuk. Az oldathoz Nessler-reagenst adva ammóniumszulfát standard oldattal szemben kolorimetráljuk azt NH3-nitrogén meghatározás céljából. E kísérleti feltételek során az 1. tápoldatban növesztett baktériumsejtek esetén 0,025—0,04%, a 2. tápoldatban növesztett sejtek esetén 0,035— 0,065% és a 3. tápoldatban növesztett sejtek esetén 0,04% N keletkezett. (Maximálisan lehasítható N 1% L-aszparagint tartalmazó reakcióelegyben: 0,106% N.) Az Escherichia coli sejtek relatív L-aszparagináz aktivitásának mértékét úgy kapjuk meg, hogy a kolorimetriásan meghatározott N-koncentrációt a kísérleti reákcióelegyben jelenlevő baktériumsejt-koncentráció hígítási faktorával megszorozzuk. így az 1. tápoldatban növesztett sejtek esetén a relatív L-aszparagináz aktivitás tízszer 0,025—0,04 vagyis 0,25—0,40, a 2. tápoldatban növesztett sejtek esetén tízszer 0,035—0,065 vagyis 0,35— 0,65 és a 3. tápoldatban növesztett sejtek esetén hatszor 0,04 azaz 0,24. A nyers L-aszparagináz L-aszparagináz aktiívitását a Cancer Research 26 (1966) 2013—2017 oldalán leírt módszerrel határoztuk meg. A találmány szerinti eljárással nyert L-aszparagináz gyógyszerként alkalmazható olyan daganatokkal szemben, amelyek növekedéséhez L-aszparagin szükséges, mint növekedési anyag. Az ilyen jellegű felhasználás esetén célszerű a találmány szerinti eljárás során kapott L-aszparaginázt tovább dúsítani, ill. tisztítani. <>
