159840. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparigináz előállítására
5 Az alábbi példákban „bázis" elnevezésű ve-CH3 i gyületen az [—NH—<CH2 ) 3 —N—(CH 2 ) 3 —NH— —(CH2 ) 3 —]„ képletű nagymolekulájú (mólsúly 5 1000 felett) terméket értjük, mely di-(3-amino-n-propil)-metilamin és epiklórhidrin reakciója során keletkezik. 1. példa: 10 10%-os kukoricalekvár oldatot (a százalék a szárazanyag tartalomra vonatkozik) 2 n kálilúggal pH 7-re állítunk be, 20 perc alatt 120 °C-ra melegítjük, és lehűtés után szűrő-eentri- 15 fugán vagy Seitz-szűrőn megszűrjük. Az ily módon kapott kukoriealekvár oldat 30 literjét 170 1 csapvizzel hígítjuk. A fent leírt tápoldat első változatát (továbbiakban 1. tápoldat) úgy készítjük, hogy 1,2 kg nátriumlaktátot és 20 0,4 kg ammóniumszulfátot adunk hozzá, míg a 2. tápoldat előállítása céljából 0,6 kg nátriumlaktátot, 0,3 kg L-glut aminsav as Na-ot, 0,3 kg glikollt és 0,4 kg ammóniumszulfátot adunk hozzá. A kapott tápoldatot egy fermentorban 25 40 percig 110 °C-on sterilizáljuk, majd lehűtjük, azután 500 ml 18 órán át 30 °C-on tenyésztett Escherichia coli ATCC 9637 rázott kultúráját, 1,5% élesztőkivonatot és 0,5% nátriumlaktátot tartalmazó 500 ml tápoldattal oltjuk be 3Q pH 7-nél. A fermentációs keveréket 30 °C-on, percenként 80 1 levegővel, 150 fordulat/perc keverési sebesség mellett levegőztetjük. 2. példa: s5 16—18 órai növekedési idő után — amikoris a kultúra pH-ja kb. 8,8-ra emelkedik — a kultúrát kb. 20 °C-ra lehűtjük. Az L-aszparaginázt tartalmazó baktériumokat 1 liter 2,5%-os „bá- 4Ü zis" oldat hozzáadása révén kicsapjuk, szűrőcentrifugán elválasztjuk az oldattól és csapvízzel 20 l-re kiegészítve felszuszpendáljuk. 3. példa r 45 A 2. példában kapott sejtszuszpenzióba keverés közben 80 1 acetont öntünk, és 20 ml 2,5%os „bázist" adunk hozzá. A kicsapódott baktériumokat szűrőcentrifugán leszűrjük, és a sejt- 50 tömeget csapvízzel 20 l-re kiegészítve ismét felszuszpendáljuk. 4. példa: 55 Az L-aszparagináznak a baktériumsejtekből történő extrakciójához a 3. példában kapott szuszpenziót 4,5 órán át 30 °C-on kevertetjük Ez idő alatt a pH-t n nátronlúg, ill. 10%-os ecetsav hozzáadása révén 7,5—7,8 közötti értéken tartjuk. Végül a szuszpenziót kb. 20 °C-ra lehűtjük. A kiadásért felel: a Közgazdasági 7207579. Zrínyi (T) Nyomda, Budape 6 5. példa: A 4. példában leírt módon extrahált sejtszuszpenzióba keverés köziben 2,5 1 2,5%-os „bázis" oldatot öntünk, és a képződött dús csapadékot — amely az extrahált baktériumokból és az oldhatatlan „bázis"-nukleinsav-fehérje komplexből áll — szűrőcentrifugán kiszűrjük. A csapadékot kidobjuk. Kb. 17 liter tiszta oldatot kapunk, amely más sejt-alkotórészeken kívül L-aszparaginázt tartalmaz. 6. példa: Az 5. példa során kapott oldatból a nyers L-aszparaginázt 68 1 aceton hozzáadása révén kicsapjuk. A keletkező csapadékot elkülönítjük, acetonnal átmossuk és vákuumban 25—30 °C-on megszárítjuk. Kb. 100 g nyers L-aszparaginázt kapunk. Az 1. tápoldat használata esetén kb. 3,3, a 2. tápoldat használata esetén pedig kb. 4,0—4,5 nemzetközi egység/mg L-aszparagináz aktivitású terméket kapunk. A 3. tápoldat alkalmazása esetén kb. 2,5 nemzetközi egység/ /mg aktivitású nyers L-aszparaginázt kapunk. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás L-aszparagináz előállítására, azzal jellemezve, hogy Escherichia coli ATCC 9637 sejteket tenyésztünk, a kifejlődött sejteket 1000 fölötti molekulasúlyú szerves bázisokkal vagy azok sóival kicsapjuk, az elkülönített sejteket acetonnal vagy más vízzel elegyedő vagy vízzel korlátozottan elegyedő szerves oldószerrel feltárjuk, a sejtéket vízzel extraháljuk, az extrahált sejteket, nukleinsavakat és szennyező fehérjéket 1000 fölötti molekulasúlyú szerves bázissal eltávolítjuk, és a csapadéktól elválasztott oldatból az L-aszparaginázt acetonnal vagy más, vízzel korlátlanul vagy korlátozottan elegyedő szerves oldószerekkel kicsapjuk és elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás fogánatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést olyan tápoldatban végezzük, amely kukoricalekvárt és/vagy élesztőkivonatot, szerves savak sóit, így tejsavat, borostyánkősavat, fumársavat vagy L-almasavat és ammóniumionokat tartalmaz, továbbá mentes Escherichia coli által erjeszthető szénhidrátoktól. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést olyan tápoldatban végezzük, amely a 2. igénypontban megnevezett alkotórészeken kívül L-glutaminsavat, L-aszparaginsavat, DL-alanint vagy glikokollt vagy az említett aminosavak sóit tartalmazza, továbbá mentes Escherichia coli által erjeszthető szénhidrátoktól. és Jogi Könyvkiadó igazgatója, st V., Balassi Bálint utca 21—23. 3
