159840. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparigináz előállítására
MAGYAR SZABADALMI 159840 NÉPKÖZTA RS AS AG LEÍRÁS ^Épi^ Nemzetközi osztályozás: díPwBSw C 12 d 13/10 ^^^P Bejelentés napja: 1969. II. 12. (BA—2173) i^P Német Szövetségi Köztársaság-beli elsőbbsége: 1968. V. 06. (P 17 67 390.4) "f "••*''" ORSZÁGOS Közzététel napja: 1971. VII. 29. TALÁLMÁNYI v' ••i: ; ---; '---» HIVATAL Megjelent: 1972. XII. 30. Feltalálók: Dr. Wagner Otto vegyész, Wuppertal-Elberfeld, Dr. Bauer Klaus vegyész, Wuppertal-Elberfeld, Dr. Kaufmann Wilfried biokémikus, Wuppertal-Vohwinkel, Dr. Rauenfouseh Erich vegyész, Wuppertal-Elberfeld, Dr. Arens Alfred vegyész, Wuppertal-Elberfeld, Dr. Irion Eckaart vegyész, Wuppertal-Elberfeld, Német Szövetségi Köztársaság Tulajdonos: Farbenfabriken Bayer AG. cég, Leverkusen, Német Szövetségi Köztársaság Eljárás L-aszparagináz előállítására Az L-aszparagináz ismert anyag. Escherichia coli sejt belsejében fordul elő [H. A. Campbell, L. T. Mashburn, E. A. Boyse, L. J. Old, Biochemistry 6. (1967) 721—730, itt további irodalmi utalások] és „Escherichia coli B" = E. coli 5 ATCC 11303 sejttömegből nyerték a következő módon. A baktériumsejteknek ultrahanggal való roncsolása vagy alumíniumoxiddal való eldörzsö- io lése útján az enzimet felszabadították, a sejt-törmeléket és a nukleinsavakat mangánkloriddal kicsapták, majd centrifugálták, s a csapadéktól elválasztott oldatból a nyers enzimet ammóniumszulfáttal kicsapták, dializálták és is DEAE-cellulóz oszlopon kromatográfiásan tisztították. Az Escherichia coli sejtek tenyésztése húsleves tápoldatban, pepton oldatokban, „Trypti- 20 case Soy Agar"-on és „Dehydrated Bacto-Nutrient Broth" 0,8%, glükóz 1,0%, dinátrium-hidrogénfoszfát 0,6% és káliumdihidrogénfoszfát 0,3% összetételű tápoldatban történt [H. A. Campbell, L. T. Mashburn, E. A. Boyse, L. J 25 Old. Biochemistry 6 (1967) 720—730 oldal; J. Roberts, M. D. Prager, N. Bachynsky, Cancer Research 26 (1966) 2213—2217 oldal]. Ezek a munkamódszerek azonban az enzim üzemi méretű kinyerésére nem alkalmasak. 30 Azt találtuk, hogy az L-aszparagináz üzemi léptékben és jó kitermeléssel előállítható, ha Escherichia coli sejteket tenyésztünk, a kifejlődött sejteket 1000 feletti molekulasúlyú szerves bázisokkal vagy azok sóival kicsapjuk, az elkülönített sejteket acetonnal feltárjuk, a sejteket vízzel extraháljuk, az extrahált sejteket, nukleinsavakat és szennyező fehérjéket 1000 feletti molekulasúlyú szerves bázisokkal vagy azok sóival kicsapjuk és eltávolítjuk, s a csapadéktól elválasztott oldatból az L-aszparagtnázt kicsapjuk és elkülönítjük. Organizmusként Escherichia coli ATCC 9637-1 alkalmazunk, a gyakorlatban azonban minden más Escherichia coli törzs is megfelelő, például az Escherichia coli ATCC 4157, 8677, 8739, 9723, 10536, 10586, 11105, 11126, 11303, 12142, 12408, 12911, 13676, 13706, 13762 és 14948. Rázott kultúrákkal való kísérletek azt mutatták, hogy úgynevezett „szintetikus" tápoldatok és az eddig erre a célra használt ismert táp.r oldatok alkalmazása csak gyenge L-aszparagináz képződéshez vezetnek. Ezzel szemben magas enzimaktivitással rendelkező baktériumsejteket kapunk, ha olyan tápoldatokat alkalmazunk, amelyek a szükséges szervetlen ionok, aminosavak és peptid-elegyek — amelyek sejtautolizátumok vagy fehérjehidrolizátumok formájár ban N^forrásként szolgálnak — mellett megfelelő szerves savakat, mint C-forrást tártai-159840
