159839. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparagináz dúsítására

11 159839 12 juk. Maximálisan 190 egység/mg protein fajlagos aktivitású L-aszparaginázt kapunk; ez a kiindulási aktivitásra számolva 60-80%-os kitermelésnek felel meg. Kristályos L-aszparagináz előállítása: 12. példa 200 g 97 egység/mg aktivitású nyers aszparaginázt 10 4000 ml glikplpufferben, amelynek pH-értéke 8,5 (Biochemisches Taschenbuch, 91, 1964), feloldunk és 30 perc alatt 60 C° hőmérsékletre melegítjük az oldatot. Ekkor az inaktív protein kiválik, mig az enzim változatlanul oldatban marad. A csapadékot 15 6000/perc fordulatszám mellett centrifugázzuk és a tiszta oldatot acetonnal frakcionáljuk. 40—45% aceton hozzáadása esetén 16,4 g anyag válik ki, amelynek aktív anyag tartalma 863 egység/mg. Ebből a dúsított aszparaginázból 9,3 g-ot 190 ml 3 20 mólos karbamid-oldatban feloldunk, az oldat pH-ját 8,5 értékűre állítjuk be és poletilénglikollal (50%-os vizes oldat) frakcionáljuk. A 22-30 ml hozzáadása után kiváló frakciót a szokásos módon kinyerjük. A kitermelés 2,1 g; aktív anyag-tartalom 3130 egység/ 25 mg. A kísérletből kapott anyag 4,0 g-ját 40 ml, kétszer desztillált vízben feloldjuk, 1 n sósavval az oldat pfiját 5,2 értékűre állítjuk be és polietilénglikol oldattal frakcionáljuk. A 12,5—15 ml hozzáadása 30 után kiváló részt 20 percnyi állás után szobahőmérsékleten centrifugázzuk és 2 óra hosszat acetonban állni hagyjuk, majd további acetonnal mossuk. Kitermelés: 1,2 g, az aktív anyag tartalom 6110 egység/mg. 35 Lapos prizmák. Barna színeződés 225 C -nál zsugorodás 260 C°-on, habosodás 270 C°-on, teljes elbomlás 274 C°-on. Az így kapott kristályokat vizes oldatból szerves oldószer, pl. aceton vagy alkohol vagy polietilénglikol 40 hozzáadása segítségével átkristályosítjuk. A kristályok elemzésének eredményei az alábbiak: Víztartalom: 12,5% (A H2

0 tartalom meghatározás 6 órás 110 C° hőmérsékleten, erős vákuumban végzett speciális 45 J.Unterzaucher-féle szárító-pisztoly (Mikrochem. 18,315 (1935) segítségével történt. A súlyállandóságról folytatólagos szárítással bizonyosodtunk meg). , Izzítási maradék: 0,11% 50 (A protein hamutartalmának meghatározása F. Pregl és H.Roth módszere szerint történt (Quantitative organische Mikroanalyse, 174. oldal Springer, Wien (1949)). Proteintartalom: 88,0% 55 (A protein meghatározás a biuret módszer szerinti triklórecetsavas kicsapással történt. (TJí.Weiselbaum, AmJ.Clin.Path. (Techn.Sec), 10^ (1946)). össztérfogat: 4 ml (ebből 2 ml biuret-reagens): 1 cm 60 E . 12,3 = mg protein/ml kísérleti oldat 546 mu A szedimentációs állandó értéke: 1 % 65 S =4,33 20° Az 1. ábra a kristályos L-aszparagináz infravörös spektrumát mutatja, a felvétel KBr-technikával készült. A 2. ábra a preparátum UV-spektrumát mutatja. Készülék: Zeiss spektrálfotométer PMQ H/erősítés 1/1(0 Rétegvastagság: 1 cm Koncentráció: mindannyiszor 1 mg H2

0 és sómentes preparátum milliliterenként. Oldószer: pH 7 értékű foszfát puffer (Merck Titrisol Nr. 9887). A 3. ábra ismételt felvétel az L-aszparagináz kristályokról. Pirogénanyagok leválasztása: 13. példa 30 g DEAE-dextrángélt (dietilaminoetil-dextrángél=DEAE-Sephadex A 50^, Aktiebolaget Pharmacia, Uppsala, Svédország, cég terméke) a szokásos módon 0,02 mólos glicin, 0,02 mólos ammóniumformiát puffer - pH érték 7,8 - oldattal előkezelve pufferolunk és 3,2 cm átmérőjű oszlopba töltjük. Agymagasság: 90 cm. 500 mg 100 egység/mg tisztaságú nyers L-aszparaginázt a fenti puffer 50 ml-ében feloldunk és az oszlopra feltöltjük. Ezután az enzimet úgy eluáljuk, hogy az eluáló folyadék koncentrációját lineáris mértékben fokozzuk 2 liter fenti puffer oldattal kezdve, 2 liter 0,02 mólos glicin, 1 mólos ammóniumformiát — pH érték 7,5 — puffer végső oldatig. Az aszparagináz tartalmú frakciókat egyesítjük, az anyagot kifagyasztással kinyerjük. Kitermelés: 1,03 g, összaktivitás: 27.800 egység = 83%. A specifikus aktivitás 210 egység/mg protein. Pirogén próba házi nyúlon végrehajtva: 5 házi nyúlnak 200 egység/állatsúly.kg mennyiséget adtunk be. A hőmérsékletemelkedés középértéke 0,48 C° volt. Azonos körülmények között a kiindulási anyag 1,6 C° hőmérsékletemelkedést okozott. 14. példa 30 g DEAE-dextrángélt a szokásos módon 0,05 mólos ammóniumacetát oldattal - pH érték 7,5 — előkezelve pufferolunk és 3,2 cm átmérőjű oszlopba töltjük. Ágymagasság: 95 cm. 500 mg 39,7 egység/mg tisztaságú nyers L-aszparaginázt 50 ml 0,05 mólos ammóniumacetát oldatban — pH érték 7,5 — feloldunk és az oszlopra feltöltjük. Az eluciót lineáris mértékben emelkedő koncentrációjú eluáló folyadékkal végezzük, kezdve 2 liter 0,05 mólos ammóniumacetát oldattal - pH érték 7,5 -, befejezve 2 liter 1 mólos ammóniumacetát oldattal (pH érték 7,5). Az aszparagináz tartalmú frakciókat egyesítjük. A kitermelés összaktivitásban 18.600 egység - 94%. Specifikus aktivitás: 200 egység/mg protein. Pirogén próba házi nyúlon végrehajtva: 300 egység/ állatsúly kg adagolás mellett a hőmérsékletemelkedés középértéke 0,4 C°. 6