159839. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparagináz dúsítására

159839 13 14 A kiindulási anyaggal végezve a próbát 200 egység/ állatsúly kg adagolás mellett a hőmérséklet-emelkedés 1,6 C°. Dietilaminoetil-cellulózzal végrehajtott tisztítás összehasonlítás céljából: 30 g DEAE-cellulózt 0,05 mólos ammóniumacetát oldattal - pH érték 7,5 - kiegyensúlyozunk és oszlopba töltjük, 500 mg nyers L-aszparaginázt (34 egység/mg) a fenti puffer oldat 50 milliliterében feloldunk és az oszlopra feltöltjük. Az eluciót lineáris mértékben emelkedő koncentrációjú eluáló folyadékkal végezzük, kezdve 1 liter 0,05 mólos ammóniumacetát oldattal - pH érték 7,5 -, befejezve 1 liter 0,5 mólos ammóniumacetát oldattal (pH érték 7,5). A kitermelés összaktivitásban: 14,000 egység = 82%. Specifikus aktivitás 89 egység/mg protein. Pirogén próba házi nyúlon végrehajtva: 200 egység/ állatsúly kg. adagolás mellett a hőmérséklet-emelkedés középértéke 1,0 C°. Azonos körülmények mellett a kiindulási anyag 1,8 C° hőmérséklet-emelkedést okozott. Más kísérleti feltételek mellett sem érhető el a pirogének nagyobb mértékű eltávolítása; ez a tény a találmány szerinti eljárás haladóbb voltát világosan bizonyítja. 15. példa 490 g DEAE-dextrángélt a szokásos módon előkezelünk és 0,05 mólos ammóniumacetát oldattal - pH érték 7,5 -, amelyhez előzőleg 20 mg/liter mertiolátot adtunk, pufferoljuk. A szuszpenziót 4 C° hőmérsékletűre hűtött, 20 cm átmérőjű oszlopba töltjük. Ágymagasság: 65 cm. 9,8 g 46 egység/mg tisztaságú nyers aszparaginázt feloldunk 880 ml 0,02 mólos ammóniumacetát-oldatban — pH érték 7,5 — és az oldatot az oszlopra feltöltjük. Az eluciót 10 1 0,05 mólos ammóniumacetát oldattal — pH érték 7,5 — kezdve a koncentrációt lineáris mértékben fokozva 10 1 0,5 mólos ammóniumacetát oldattal - pH érték 7,5 - befejezve végezzük. A kitermelés összaktivitásban 365.000 egység, az indulási anyagra számolva 81%. Pirogén próba házi nyúlon végrehajtva: 200 egység/ állatsúly kg. adagolás mellett a hőmérséklet-emelkedésközépértéke 033 C°. A kiindulási anyaggal végezve a próbát azonos körülmények között a hőmérséklet-emelkedés 1,8 C°. 16. példa 10 g DEAE dextrángélhez, amelyet 0,05 mólos ammóniumacetát oldatban — pH érték 7,5 — pufferoltunk, hozzáadjuk 100 mg 39,7 egység/mg tisztaságú L-aszparagináz 0,05 mólos ammóniumacetát oldatban - pH érték 7,5 - készített oldatát. Az elegyet 15 percig keverjük, majd leszívatjuk. Az üledéket egymást követően különböző ionerősségű puffer oldattal eluáljuk (1. táblázat). A kis ionerősség mellett eluált L-aszparagináz részletek pirogén-tartalmúak, míg a nagyobb ionerősségű pufferrel kimosott részletek pirogénmentesek. A kitermelési adatok a táblázatból kiolvashatók. Puffer pH Akti- Kiter- Pirovitás melés genitás egység % állathő-5 mérsékletkülönbség C° 0,05 mólos ammóniumacetát 7,5 5010 24 1,1 0,10 mólos ammóniumacetát 7,5 3820 18 1,2 0,20 mólos ammóniumacetát 7,5 7850 37 0,9 0,40 mólos ammóniumacetát 7,5 4060 19 0,3 0,80 mólos ammóniumacetát 7,5 520 2 0,3 17. példa 100 g 100 egység/mg fajlagos aktivitású aszparagi-25 názt 1 liter vízben feloldunk. Hozzáadunk kb. 40 g glicint és az oldat pH-értékét 8,9-re állítjuk be. Az oldatot 90 órán át +50 C° hőmérsékleten tartjuk, majd a kiváló fehérjét 6000/perc fordulatszám mellett 20 perc alatt centrifugáljuk. A tiszta oldat pH-ját 5,2 30 értékűre állítjuk 2 n HCl oldattal és 50%-os polietilénglikol-oldattal frakcionálva kicsapjuk. A mintegy 200 ml polietilénglikol hozzáadása után kiváló részletet centrifugázzuk, acetonnal mossuk és megszárítjuk. Kitermelés: kb. 35 g 200-220 egység/mg tiszta-35 ságú anyag. A 4. ábra a termék minimális pirogén tartalmát mutatja. 18. példa 40 A 17. példában leírtak szerint járunk el, de az L-aszparagináz oldatot 24 óra hosszat 60 C° hőmérsékletre melegítjük. 19. példa A 17. példában leírtak szerint járunk el, de az oldat pH-értékét kb. 8,2-re állítjuk be. 50 20. példa A 18. példában leírtak szerint járunk el, de csak 20 55 g glicint adunk az L-aszparagináz oldathoz. 21. példa 60 100 g 100 egység/mg fajlagos aktivitású L-aszparaginázt feloldunk 1 liter vízben. 100 ml metanolt és 40 g glicint adunk hozzá és az oldat pH-ját 8,9-re állítjuk be. Az oldatot 90 órán át +50 C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd a kiváló fehérjét 6000/perc fordulat-65 szám mellett 20 perc alatt lecentrifugáljuk. A tiszta oldat pH-ját 5,2 értékűre állítjuk 2 n HCl-oldattal és 50%-os polietilénglikol hozzáadása után kivált részle-7