159839. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparagináz dúsítására

9 159839 Frakciószám Kitermelés g Egység/mg %-os egységtartalom a kiindulási nyers aszparaginázra számolva 1 2 3 4 1,381 0,362 0,155 1,00 790 1930 640 180 38 24 3 6 Karbamid vagy más amidok hozzáadása: 5. példa 5 kg nyers aszparaginázt (amelyet a leírt módon állítottunk elő) szobahőmérsékleten 40 liter desztillált vízbe adagolunk. A lassan képződő oldat pH értékét, kb. 1,5 liter 1 n NaOH oldattal 8,5-8, 9-re állítjuk be. Ezután kb. 3 mól/liter koncentráció eléréséig karbamidot adunk hozzá. Ennek során az oldat hőmérséklete kb. 10 C°-ra süllyed. Az oldatot további egy órán át keverjük, majd 4 C° hőmérsékleten 16-24 órán át állni hagyjuk. Ez idő után 25-30 liter 50%-os polietilénglikol hozzáadásával kicsapjuk az I. frakciót, amelyet kidobunk. A II. frakciót további 15 liter 50%-os polietilénglikol hozzáadásával csapjuk ki. A II. frakció tartalmazza az aktív anyag fő tömegét. A II. frakció fölött maradt oldathoz további 15 liter polietilénglikol oldatot adva kapjuk a III. frakciót, amely a kiindulási aktív aszparagináz 20— 25%-át tartalmazza. A n. frakciót kb. 2,5 liter desztillált vízben felvesszük. 250 ml 50%-os polietilénglikol oldat hozzáadásával kicsapjuk az I.a frakciót; további 250 ml polietilénglikololdat hozzáadásával nyerjük a Il.a frakciót. Hasonló módon kapjuk a Ilí.a és IV.a frakciókat. A frakcionálás során elért tisztasági fokozatokat és kitermelési adatokat az alábbi táblázat tartalmazza; 6. példa Az 5. példában leírt módon járunk el, de karbamidkoncentrációt kb. 6 mól/liter-re emeljük, az oldat ezt követő állásideje pedig csak 2 óra. A 10 15 20 25 30 35 40 kitermelési adatok messzemenően megegyeznek az 5. példa szerinti adatokkal. 7. példa Az 5. példában leírt módon járunk el, de karbamid helyett guanidinhidrokloridot adagolunk kb. 2 mól/ liter koncentrációnak megfelelő mennyiségben. Az oldat állásideje 2 óra. A kitermelési adatok az 5. példa szerinti adatokkal azonosak. Kicsapás az izoelektromos ponton: 8. példa 100 g kb. 100 egység/mg protein fajlagos aktivitású L-aszparaginázt 1000 cm3

desztillált vízben, szobahőmérsékleten feloldunk. Az oldódás lejátszódása folyamán a pH-értéket 1 n NaOH-oldattal 8,5— 8,9-re állítjuk be. Az ezt követően visszamaradt, fel nem oldódott anyagot 10 perces, 6000/perc fordulatszámú centrifugálással eltávolítjuk. A tiszta oldat pH-értékét jegelés közben lassan 7—6,8-ra állítjuk be. A képződött olajos üledéket 25 perces, 6000/perc fordulatszámú centrifugálással leválasztjuk. A centrifugálás során nyert tiszta oldatot 1 n HCl-oldattal pH 5,3 értékűre állítjuk be. Ezután lépésenként 25—25 ml 50%-os polietilénglikol oldatot adagolunk és minden alkalommal 6000/perc fordulatszám mellett 10 percen át végzett centrifugálással nyerjük ki az üledéket. Ily módon 5-6 frakciót kapunk, az aktív anyag fő tömegét a legnagyobb, fajlagos aktivitású 3—5 frakciók tartalmazzák. Kitermelés: 60-70%. 9. példa A 8. példában leírt módon járunk el, de polietilén^ glikol helyett 4 lépésben, az oldat 20 térfogat%-ának megfelelő hideg acetont adagolunk. A kitermelés a 8. példa szerintihez hasonló. FrakcióKitermelés Egység/mg %-os enzimszám g (1 perces aktivitás egység) a kiindulási nyers aszparaginázra számolva la 1,6 19,4 0,3 Ha 8,1 100,0 8,0 ma 23,0 144,0 31,2 IVa 16,2 74,0 11,5 Va 18,9 25,0 4,6 55,6 45 10. példa A 8. példában leírt módon járunk el, de polietilén-50 glikol helyett 5 lépésben, az oldat 20 térfogat%-ának megfelelő etilalkoholt adagolunk. A kitermelés a 8. példa szerintihez hasonló. 55 11. példa 100 g 140 egység/mg protein specaktivitású L-aszparaginázt 500 ml vízben feloldunk és az oldat pH-értékét 1 n NaOH-oldattal 8,5 értékűre állítjuk be. 60 A fel nem oldódott anyagot 15 percen át 6000/perc fordulatszám mellett centrifugáljuk. A tiszta oldat pH-értékét 6,8-ra állítjuk be 1 n HCl-oldattal 4 C° hőmérsékleten és a keletkező csapadékot centrifugáljuk. A A centrifugálás után kapott tiszta oldat a 65 pH-értékét lassan adagolt In HCl-oldattal 5,0—5,l-re állítjuk be, majd 4 C° hőmérsékleten több órán át állni hagyjuk. A keletkezett csapadékot centrifugál-5