159745. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 13béta-rövidszénláncú alkil-3-metoxi-17béta-hidroxi-8,14 szekogona-1,3,5(10),9(11)-tetraén-14-on vegyületek előállítására
3 159745 4 talajon nőtt tenyészet a kiindulási vegyületből a megfelelő 17'/?-hidroxi-származékot és ennek további redukciós termékét, a 14a,17</?-dihidroxi-származékot alakítja .ki.- Tovább folytatva vizsgálatainkat, azt az új megfigyelést tettük, hogy ha a szübsztráttal a 3-metoxi-8,14-szeko-1,3,5 (10), 9(1 l)-asztra;tetraén-14,;17-dionnal együtt egy illetve kétgyűrűs, aromás, poláros szubsztituált vegyületeket is adtunk a fermentléhez, akkor ez a 3-metoxi-8,14-,szeko-l,3,5('10),(9{ll)-ösztratetraén-44a,17!/?-diol képződését visszaszorította és végtermékként a fermentáció h&fejezésekor csak a kívánatos 3nmetoxi-8,il4--széko-1,3,5(10) ,9(11 )-ösztratetraén-,l 7!/?-ol-l 4r-ont kaptuk. A fermentáció során a hőmérsékletet emelve, vagy a tenyészet intenzív levegőztetése esetén nitrogén- és szénforrásban gazdag táptalajt alkalmazva, a fentieknek megfelelően a keletkezett redukciós termékek között a 17!/?-hidroxi-4 4-oxocsoportot tartalmazó vegyület keletkezésének visszaszorulását tapasztaltuk a 14a-hidroxi-csoportot tartalmazó származékok javára. Ha az előbb említett természetes szekoösztratetraéndion homológjait kíséreltük meg enzimatikusan redukálni, akkor a '/?-naftol és rokonvegyületeinek fokozott hatását tapasztaltuk. A 13ß-etil-3-metoxi-8,14-szeko-l ,3,5(10) ,9(11) --4gonatetraén-14,17-dion egyébként lassú redukciója során, ß-naftol jelenlétében az átalakítás sebessége eléri a 3-metoxi-8,14HSzeko-l,3,5(10),-9(ll)-ösztratetraén-14,17-dion sztereospecifikus redukciójának sebességét. A fenti vegyületek az enzim felületén kifejtett hatásukkal elősegítik az enzim működését, látszólag aktiválják azt. A találmány tárgya új eljárás v 13<#-alkil-3--metoxi-17^-hidroxi-8,l 4-szekogona-l ,3,5(10),9-(ll)-tetraén-14-on vegyületek előállítására 13/?-alkil-3-metoxi-8,14-szekogona-l,3,5(10),9<ill)-tetraén-14,17-dion-vegyületekből élesztő-tenyészettel vagy sejtszuszpenzióval, illetve az azokból nyert sejtmentes enzimoldattal végzett fermentálás útján. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a fermentációt legfeljebb 30 C° hőmérsékleten, előnyösen 20—24 C°-on, egy- vagy kétgyűrűs aromás, poláros szubsztituenst tartalmazó vegyületek jelenlétében, szinkron növekedő tenyészetben folytatjuk le. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja értelmében egy- vagy kétgyűrűs aromás vegyületként fenolt, naftolt, naftalinszulfonsavat vagy naftilamint használunk. Maximális átalakítási sebességet a szinkronizáltan növekedő tenyészet felhasználásával tudtuk elérni. Hat órás tenyésztési periódusban indukáltuk az átalakítást végző mikroorganizmus enzimrendszerét, majd ezután adagoltuk az átalakítandó vegyületet. Az átalakítandó szubsztrátum koncentrációját 25—30 órán keresztül 0,1%-os értéken tartottuk, majd 50 órás korban, a bevitt szubsztrát 90—95%ániak átalakítása után a fermentációt befejezettnek tekintettük. A találmány szerinti eljárás gazdaságos lehetőséget biztosít hormonhatású szteroidok totálszintéziséhez, szükséges optikailag aktív intermedierek, mint 3-metoxi-8,14^szek!o-l,3,5-(10),9(ll)-ösztratetraén^l7/5-ol-44-on és a 13ß-etil-3-metoxi-8,14Hszéko-l,3,5(10),9(ll)-gonatetraén-17i/?-ol-14-on előállítására fermentációs úton valamely mikroorganizmussal, ezen belül élesztők felhasználásával. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg, 1. példa: Saccharomyces uvarum (MNG 55) törzs ferde-agar tenyészetével vattadugóval lezárt 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 100 ml térfogatú, 2% kukoreialekvárt, 3% glükózt tartalmazó steril táptalajt oltottunk. Az indulási élő sejtszám 2 x 1Ö6 volt ml-enként. A beoltott lombikokat 28 C°-os termosztált szobában 260-os fordulatszámú, 2 cm kitérésű síkrázóasztalon inkubáltuk. 8 órás tenyészethez 20 ing 3-m€Íoxi-8,14-szieko-l, 3,5(10),9(ll)-ösztra tetraén-14,17-diont adagoltunk 1 ml etanolban oldva. A tenyészeteket 3 különböző hőmérsékleten, 24, 28 és 37 C°-on, azonos teljesítményű szitarázógépeken rázattuk. 16 óra múlva a lombikok tartalmát diklóretánnal extraháltuk. Az extraktumban található vegyületeket prepáratív szilikagél lemezen 4-szer egymás után futtatva. 93% kloroformot és 2% acetont tartalmazó rendszerrel elválasztottuk, majd az egyes komponensek mennyiségét UV abszorpció alapján meghatároztuk. E2 os = 20 700. Az eredményeket az I. táblázatban foglaltuk össze. 2. példa: fi0 Saccharomyces uvarum (MNG 55) törzs fer' de-agar -tenyészetével vattadugóval lezárt 500 ml-es Erlenmeyer lombikokban levő 100 ml térfogatú 2%, kukoricalekvárt, 3% szacharózt tartalmazó steril táptalajt oltottunk. Indulási 55 sejtszám 2,5 x 10B /ml 12 órás, 24 C°-os percenként 280 fordulatú rázőasztalon végzett iinkubálás után a lombikokba 50—©0 mg 3-mefcoxi-8,14-szekcHl,3,5i(10),9'(ll)-£sztratetraén-14,-17-diont, valamint a szübsztráttal egyidőben 6 60 mg gátlószert (naftolt, naftalint, naftilamint, naftalinszulfonsavat, fenolt) adagoltunk. 24 órán át 24 C°-<on végzett inkubálás után mértük a keletkező termékek .mennyiségét az 1. példa szerint. Az eredményeket a II. táblázatit ban foglaltuk össze. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
