159688. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bleomicin antibiotikumok előállítására
23 159688 24 ho 1-ből (felületaktív anyag kereskedelmi neve) álló közeghez 0,4 g/ml arányban 3^aminopropil-jdimetilszulfóniumbromid-Jhidrobromátot adunk, miáltal a közeg pH-értékét 6,5-re állítjuk be. Az így beállított tápközegből 100—100 ml-t egy-egy Sakaguchi-lombikba töltünk és sterilizáljuk. Ezt követően a közeghez aszparagin-glukóz ferde agáron tenyésztett Streptomyces verticillus ATCC 15003 törzzsel beoltott árpaszeimeket adunk és a tenyésztést 8 napon át folytatjuk 27 C°-on percenként 1300 fordulatszámú keverés közben. Ezután a tápoldatokat egyesítjük (4,5 liter), szűrjük és ily módon 3,0 -liter szűrletet kapunk (hatóképesség 138 mqg/ml, teljes hatóképesség 416,4 mg). A tápoldat-szűrletet 200 ml Amberlite IRC—50-el töltött (H-típusú ioncserélőgyanta kereskedelmi neve) oszlopon visszük keresztül és adszorbeáltatjuk, vízzel mossuk, és 0,5 n sósavval eluáljuk. Az eluátumlból 1 litert semlegesítünk, átvezetjük és adszorbeáltatjuk egy 100 ml aktív szénnel töltött oszlopon, vízzel mossuk és aceton, valamint 0,02 n vizes sósavoldat 1:1 ará-2. példa: 6,4% köleskocsonyából, 0,5% glükózból, 3,5% porított szójababból, 0,75% kuikoricalekvárból, 0,3% nátriumkloridból, 0,1% szekunder-kálir um-foszfátból, 0,05% cinkszulfátból, 0,01% rézszulfátból, 0,2% nátriumnitrátból és 0,01% Toho 1-ből (felületaktív anyag kereskedelmi neve) álló közeghez 2 mg/ml arányban 1,2-diaminopropánt adunk, hogy pH-értékét 6,5-re állítsuk be. Az így beállított közeg 100—100 mijét egy-egy Sakaguchi lombikba töltjük és sterilizáljuk. Ezután a tápközegre Streptomyces vertieillust (ATOC 15003 szám) oltunk és 192 órán át 27 C°-on tenyésztjük, miközben pernyú elegyével (térfogatarány) eluáljuk és a Mycobacterium 607-re aktív frakciókat összegyűjtve, szárazra bepároljuk. A kapott maradékot feloldjuk 5 ml 80%-os vizes metanololdatban és egy 30 ml semleges alumíniumoxiddal töltött oszlopra visszük, 80%-os vizes metanololdattal eluáljuk. A bleomicin tartalmú frakciókat összegyűjtjük, szárazra bepároljuk, és 195 mg bleomicin hidrokloridot kapunk (hatóképesség 650,7 mcg/mg, teljes hatóképesség 127 mg). A kitermelés a tápszűrletből 30,5%-os volt. Az így kapott terméket vizes ammóniumformiát oldattal Sephadex CM oszlopon bleomicin komponensekre választottuk szét és azt találtuk, hogy az 72,2P/0 A 2 bleomicint tartalmazott. Ezt az elválasztási módszert a következő példákban Sephadex CM módszernek nevezzük. Ugyanilyen módon végeztünk kísérleteket a 2. táblázatban feltüntetett aminovegyületekkel. Az alkalmazott körülményéket és kapott eredményeiket a 2. táblázat tartalmazza. 2. táblázat •CS S-, Az adalékanyag neve c H c o Üj, Sephadex CM-el elválasztott bleomicin neve 3-aminopropil-dimetil- 0,4 192 3,0 138,8 416,4 Bleomicin szulfóniumbromid Aa (tartalom 72,2%) hidrobromát 3-amino-3-karboxi- 40,0 192 1,65 100,0 165,0 Bleomicin propil-dimetil- A2 (tartalom 87,2%) szulfóniumkkwi'd 4-aminobutil- 2,0 240 2,0 200,0 400,0 Bleomicin -guanidin- B2 (tartalom 78,2%,) hidroklo-rid N,N'-bisz-(3-amirio- 0,2 264 1,1 150,0 165,0 Bleomicin propil)-1.4—di- A5 tartalom 90,8%) aminobután 195 650,7 127.0 30,5 140 300,0 42,0 25,5 164 800,0 131,2 32,8 62 1200,0 74,4 45,1 táblázat ÖJO fi, Üj, Sephadex CM-el hn elválasztott bleomicin neve >,4 Bleomicin 195 650,7 127.0 30,5 A2 (tartalom 72,2%) i,0 Bleomicin 140 300,0 42,0 25,5 A2 (tartalom 87,2%) 1,0 Bleomicin 164 800,0 131,2 32,8 B2 (tartalom 78,2%,) i,0 Bleomicin 62 1200,0 74,4 45,1 A5 tartalom 90,8%) oenként 130 fordulattal keverjük. Ezt követően a tápfolyadékokat egyesítjük (4,5 liter), és szűrjük; ekkor 3,56 liter szűrletet kapunk (hatóképesség 190 mcg/ml, teljes hatóképesség 55 676,4 mg). A tápoldat-szűrletet 200 ml Amberlite IRC—50-el töltött (H^típusú szintetikus gyanta kereskedelmi neve) oszlopon visszük keresztül és adszorbeáltatjuk, vízzel mossuk, majd aceton-0,02 n vizes sósavoldat 1:1 arányú 60 (térfogatarány) keverékével eluáljuk és a Mycobacterium 607-re aktív frakciókat összegyűjtve, szárazra besűrítjük. A kapott visszamaradó anyagot feloldjuk 4 ml 80%-os vizes metanololdatban és 70 ml semleges alummiumoxiddal töl-65 tött oszlopra visszük, 80%-os vizes metanolol-10 15 20 tábla: el >,4 Bl< i i,0 Bl( 1,0 Bli 1 i,0 Blí i 55 60 65 12 Koncentráció (mg/ml) Tenyésztési idő (óra) Szűrlet mennyisége (liter) Hatóképesség (mcg/mg) Teljes hatóképesség (mg) Súly (mg) Hatóképesség (mcg/mg) Teljes hatóképesség (mg) Kitermelés a tenyésztési szűrletből (%)
