159688. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bleomicin antibiotikumok előállítására

25 159688 26 dattal eluáljük. A bleomicint tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, szárazra besűrítjük, a maradékot feloldjuk 2 ml vízben és 20 ml Sephadex G—25-el töltött oszlopra visszük, majd desztillált vízzel eluáljük. A kapott, kékeszöld, bleomicint tartalmazó frakciót elkülönítettük, 0,02 n vizes ammóniumklorid oldatban szuszpendálunk, 20 ml Sephadex CM-el töltött oszlopra vittük, 0,1 mól vizes ammóniumklorid oldattal eluáltuk. Ezt követően, a kívánt anyagot tartalmazó frakciót felfogtuk és 5 ml aktív szénnel töltött oszlopra vittük, ahol a kívánt anyag adszorbeálódott, majd aceton és vizes 0,02 n sósavoldat 1:1 arányú keverékével eluáltuk. Az eluátumot szárazra bepároltuk, 35 mg 2-aminopropil-amino-bleomicint kaptunk (hatóképesség 2,173 mcg/mg, teljes hatóképesség 76,1 mg). A tápközeg-szűrletből a kitermelés 11,25%-os volt. Az így kapott anyagból 25 mg-ot feloldottunk 1 ml metanolban, az oldatba 10 percig kénhidrogéngázt vezettünk be. Ezután az oldatot szűrtük, a -szurletet szárazra pároltuk és 20 mg rézmentes 2-aminopropil-amino-bleomicin hidrokloridot (hatóképesség 2,000 meg/mg, teljes hatóképesség 40 mg) kaptunk. A rézmentes terméket 6 n vizes sósavoldattal hidrolizáltuk. majd pH=l,9-nél és 3,000 volt feszültségnél elektroforézisnék vetettük alá, miközben kimutattuk az 1,2-diaminopropánt. A fentiekhez hasonló módon a 3. táblázatban felsorolt aminovegyületekkel is végeztünk kísérleteket. A kísérletek körülményeit és a kapott eredményeket a 3. táblázat tartalmazza. 3. példa: 6,4% köleskocsonyából, 0,5% glükózból, 3,5% porított szójababból, 0,75% kukoricalekvárból, 0,3% nátriumkloridból, 0,1% szekunder-kálium-ifoszfátból, 0,05% cinkszulfátból, 0,01% rézszulfátból, 0,2% nátriumnitrátból, 0,01% szilikonból és 0,01% Totho 1-ből (felületaktív anyag kereskedelmi neve, gyártja Toho Chemical Industry Co.Ltd.) álló közeghez 2 mg/ml arányban 1,3-diaminopropánt adtunk, hogy a közeg pH-értéke 6,5 legyen. Az így beállított közegből 12 litert 20 literes üvegfermentorba töltöttünk és sterilizáltuk. Erre a közegre ráoltottuk a Streptomyces vertrcillust tartalmazó 800 ml tápfolyadékot, melyet előzőleg 48 órás rázótenyésztésnek vetettünk alá a fentiekkel azonos tápközegben és 27 C°-on, 120 órán keresztül, percenként 350—370 fordulatszámú keverés mellett tenyésztettünk, miközben percenként a közeg térfogatával azonos térfogatú levegőt vezettünk a közegbe. 7,7 liter tápfolyadékot leszűrtünk, a szűrletet (5,6 liter, hatóképesség 148,5 mcg/ml, teljes hatóképesség 831,6 mg) extraháltuk és tisztítottuk, az 1. példában leírtakkal egyező módon, miáltal 230 mg bleomicin hidrokloridot kaptunk (hatóképesség 734,8 mcg/mg, teljes hatóképesség 169 mg). A kitermelés a tápközeg szűrletből 20,3%-os volt. "> Ezt a hidrokloridot a Sephadex CM módszer szerint elemeztük, és azt találtuk, hogy 84,5% 3-aminopropilamino-bleomicint tartalmaz. 200 mg hidrokloridot feloldottunk 10 ml desztillált vízben, az oldatot 50 ml térfogatú, 0,02 n vizes 10 ammóniumformiátban szuszpendált Sephadex CM-el töltött oszlopra vittük, majd 0,1 n ammóniumformiát oldattal előhívtuk és eluáltuk, és megkaptuk a 3-aminopropilamino-bleomicint tartalmazó .frakciót. Ezt a frakciót 10 ml aktív 15 szénnel töltött oszlopon vittük keresztül és adszorbeáltattuk, vízzel mostuk és aceton-0,02 n vizes sósavoldat keverékével (1:1 térfogatarány) eluáltuk. Ezt követően a kapott aktív eluátum-frakciót szárazra bepároltuk és 50 mg 20 3-aminopropilamino-bleomicin hidrokloridot kaptunk (hatóképesség 1,934 mcg/mg, teljes hatóképesség 96,7 mg). A hidroklorid kitermelése 65,8%-os volt. 25 Ezt az anyagot 6 n sósavval hidrolizáltuk, 10%-os'nátronlúgos oldattá alakítottuk és gázkromatografálásnak vetettük alá, Fluoropack (kereskedelmi név) hordozóra felvitt Silicone SF 96-al (kereskedelmi név) töltött oszlopon, S0 miközben az 1,3-diaminopropán egyik csúcsa kimutatható volt. Az így kapott 3-aminopropilaminobleomicin hidrokloridból (hatóképesség 1,934 mcg/mg, tel-35 jes hatóképesség 58,02 mg) 30 mg-t feloldottunk 5 ml metanolban, és az oldatba 30 percen át kénhidrogéngázt vezettünk, miközben a rézszulfid leülepedett. Ezt a csapadékot szűréssel kinyertük és metanollal mostuk. Ezt köve-40 tőén a mosófolyadékot és a szűrletet egyesítettük, szárazra besűrítettük és 25 mg rézmentes 3-aminopropilamino-bleomicin hidrokloridot kaptunk (hatóképesség 1,850 mcg/mg, teljes hatóképesség 46,35 mg). A réztartalmú anyagra 45 vonatkoztatott kitermelés 79,7'%-os volt. A rézmentes 3-aminopropilamino-bleomicin hidrokloridból (hatóképesség 1,850 mcg/mg, teljes hatóképesség 37 mg) 20 mg-t feloldottunk 50 2 ml desztillált vízben és 5 ml Amberlite IRA—400 an.ioncserélő gyantával (szulfon típusú ioncserélő gyanta kereskedelmi neve, gyártja a Röhm and Haas Co.) töltött oszlopra vittük, desztillált vízzel eluáltuk, az eluátumot 55 szárazra bepároltuk és 15,5 mg rézmentes 3--aminopropilamino-bleomicinszulfátot (hatóképesség 1,850 "mcg/mg, teljes hatóképesség 28,68 mg) kaptunk. A kitermelés a rézmentes hidrokloridra vonatkoztatva 77,5%-os volt. 60 Fentiekkel azonos kísérleteket végeztünk üvegfermentorban a 4. táblázatban megadoffc aminovegyületek alkalmazásával. Az alkalmazott körülményeket és kapott eredményeket a 65 4. táblázat mutatja be. 13