159688. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bleomicin antibiotikumok előállítására

21 159688 22 Az eljárás gyakorlati kivitelezésénél előnyös olyan közeget használni, mely főleg szénhidrátokból és nitrogéntartalmú szerves anyagokból áll, mint iköleskocsonya, glükóz, keményítő, porított szójabab, kukoricalekvár stb. és amely kismennyiségű szervetlen anyagot, például káliumfoszfátot, rézszulfátot, cinkszulfátot, nátriumszulfátot, nitrátokat, stb. tartalmaz. Ebben a közegben Streptomyces verticillust, vagy a bleomicint termelő törzsek valamelyikét aerob módon tenyésztjük, a szokásos eljárások szerint Ezt követően a tápoldatot szűrjük, a szűrletet például kationcserélő gyantán, melynek reakcióképes csoportja karboxil-csoport, adszorbeáltatjuk, majd vizes sósavoldattal eluáljuk. Ezután az eluátumot egymásután aktív szénen adszorbeáltatjuk, vizes aceton és vizes sósavoldat elegyével eluáljuk, Sephadexen adszorbeáltatjuk (száraz, oldhatatlan por kereskedelmi neve, mely mikroszkópos méretű gyöngyökből áll és amelyet a poliszaceharid dextránból származó, szintetikus, szerves vegyületeket alkotnak; gyártja és forgalomba hozza a Pharmacia Fine Chemicals Inc.) és desztillált vízzel eluáljuk, miáltal bleomicinhidroklorid port kapunk. Az így kapott por további tisztítása végett előnyös kromatográfiás eluálást alkalmazni, ammóniumklorid-, vagy vizes ammóniumformiátoldattal, Sephadex CM-et használva hordozóként.' Végül az eluátumot aktív szénen adszorbeáltatjuk és egymásután vízzel mossuk, vizes aceton és vizes sósavoldat elegyével eluáljuk, miáltal tiszta bleomicin komponenst kapunk. Ha egy bleomicin komponenst a találmánynak megfelelően kellően szelektíven állítottunk elő a tápközegfoen, akkor a Sephadex CM-el történő elválasztási lépcső elhagyható. Bleomicinek rézzel kelátokat tudnak képezni és a tápközegből kék por alakjában nyerhetők ki, azonban a réz eltávolítható, ha valamelyik extrakciós vagy tisztítási lépcsőben réz-eltávolító kezelést alkalmazunk. A találmány szerint kapott bleomicinek különböző tulajdonságait az 1. táblázat tartalmazza. Az 1. táblázat különböző vegyületeinek infravörös és ultraibolya abszorpciós spektrumait a mellérendelt 1—6 számok mutatják, a következők szerint: A Szám Spektrum A vegyület neve vegyület száma 1 infravörös 3-[3-(N-butil)-aminopropilj-aminopropilamino-bleomiein 12 2 ultraibolya 3n[3H(N-butil)-<aiminopropjl]-aminopropilamino-bleomiein 12 3 infravörös 3-j(l-metil-3-aminopropil)-aminoprop:ilamino bleomicin 23 A Szám Spektrum A vegyület neve vegyület száma 4 ultraibolya 3->(l-metil-3-animo-propil)'-aminopropilamino bleomicin 23 . 5 infravörös 3-i(3-ciklohexil&mino-10 propil)-aminopropilamino bleomicin 39 6 ultraibolya 3--(3-ciklohexilaniinopropil)-aniinopropilamino bleomicin 39 15 Megjegyzések: 1) Az új (vagy fő) bleomicin tartalmát úgy mértük, hogy a korábban mutatott példák bár-20 melyikében, tenyésztéssel és tisztítással kapott bleomicint (egyedi komponensek keverékét) Sephadex CM alkalmazásával szétválasztottuk és ultraibolya abszorpciós spektrofotometrálásnak vetettük alá. 25 2) A hatóképességet biológiai vizsgálattal mértük, rézmentes A2 bleomicinhidrokloridot használva (hatóképesség 940 mcg/mg) összehasonlítási anyagként és M. tuberculosis 607-t 3' mikroorganizmusként. 3) Vékonyréteg kromatográfia: Adszorbeáló anyag: szilikagél Oldószer: metanol-10%-os ammóniumacetát-10%-os vizes ammóniaoldat 10:9:1 arányú 3^ elegye. Papírkromatográf ia: Oldószer: 10%-os vizesammóniumkloridoldat 4) N: nimhidrin reakció, S: Sakaguchi reakció Az 1. táblázatiból látható, hogy a találmány 40 szerint kapott új bleomicinek megjelenésükben és ultraibolya abszorpciós görbéjük tekintetében az ismert bleomicin komponensekhez hasonlóak, azonban hatóképesség (mcg/mg) és R/-érték tekintetében különböznek azoktól. To-45 vábbá, említésre méltó még, hogy ha ezeket az új anyagokat erős savakkal hidrolizáljuk és a hidrolizátumokat gázkromatográfiának vetjük alá, akkor a tápközegben adalékanyagként alkalmazott amino-vegyületek, vagy a tenyész-50 tés során képződő aminovegyületek kimutathatók, és bebizonyosodott, hogy ezek oldalláncai a hozzáadott, vagy a tenyésztés közben képződött aminovegyületek oldalláncainak megfelelnek. 55 A találmány részletes bemutatására szolgálnak a következő példák: 1.. példa: 60 6,4% köleskocsonyából, 0,5% glükózból, 3,5,% porított szójababból, 0,75% kukoricalekvárból, 0,3% nátriumkloridból, 0,1% szekunder-kálium-foszfátból, 0,05%. cinkszulfátból, 0,01% rézéi szulfátból, 0,2% nátriumnitrátból és 0,01% Toll