159665. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3 béta-hidroxi-delta5(10)-sztereidok előállítására
3 159665 4 -szteroidok kiindulási szteroidokként nem használhatók, mivel ezek a Simmons—Smith reakció sarán csupán a nem kívánatos lQa-metil-szerkezetet eredményezik. A 3-ketoszteroidok mikrobiológiai redukció) már ismertek (A. Achromin., A. Titow: Mikrobiol. Transformation von Steroiden, Nauka Verlag, Moskau 1065). Ezen szteroidok redukciója során mind 3ce-ihidroxiszteroidok, mind 3:/?-ihidroxiszteroidok keletkeznek. Ha szubsztrátként 3-ketoszteroidokat használunk, melyek ezenkívül 1-helyzetben, vagy 5 (6) helyzetben kettőskötést tartalmaznak,' a ketoredukció mellett gyakran a jelenlevő kettőskötés enzimatikus hidrogénezése is bekövetkezik (Kim, Enzymologia 6, 1939, 105—107, L. Lamoli és A. Verze Iloné, Ber. Dtsch. Gherh. Ges. 70; 1937, 2079). • 3-keto-^(5<10) Jszteroidok mikrobiológiai redukciója az eddigiekben még nem ismert. Mivel a zf5(I0) -kettőskötést ugyancsak enzimatikusan zH-kettőskötéssé alakíthatjuk, (S. F. Kawahara és mtsai, J. biol. Ghem. 237, 1962, 1500—1506), várható, hogy a 3-keto-zí5(10) -szteroidok mikrobiológiai úton hasonlóképpen alakítlhatók át, mint a fenti telítetlen 3-keto-szteroidok. A 3-keto-csoport mikrobiológiai redukcióját Fachmann módszerével végezzük. Először az általában szokásos előkísérletekkel a legelőnyösebb reakciókörülményeket, így pl. a választott szubsztráthoz alkalmas mikroorganizmust és a fermentáció idejét analitikai úton, főképpen rétegkromatográfiával, megállapítjuk. A preparatív előállításihoz ezután a kiválasztott mikroorganizmust az előkísérletben megállapított reakciókörülmények között a tápoldatban aerob viszonyok mellett „szubmerz" kitenyésztjük és tovább szaporítjuk és a szubsztrátot oldat vagy szuszpenzió alakjában hozzáadjuk. A fermentáció menetét célszerűen rétegkromatográfiás úton ellenőrizzük. A fermentáció befejezése után a kapott terméket megfelelő, vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel a tenyésztő folyadékból extraháljuk és az extraktból pl. bepárlással és további, ismert tisztítási műveletekkel, pl. átkristályosítással és/vagy szilikagélen végzett kromatográfiával izoláljuk. Mikroorganizmusokként baktériumok, gombák és kiváltképpen élesztők vagy az ezekből izolált enzimek jönnek számításba, Különösen alkalmasak pl. a Candida nemzetséghez tartozó élesztőgombák, így a Candida tropicalis, Candida zeylanoides vagy Candida krusei, vagy a Rhodotorula nemzetségbe tartozók, mint pl. a Rhodotorula glutinis. Ha a találmány szerinti eljárás kiindulási anyagaként 3-aIkoxi-/|2. 5 ( 10 >-szteroidokat használunk, akkor az eljárás kivitelezéséhez baktériumok kevésbé alkalmasak. A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példák szemléltetik. 1. példa: 10 15 20 6,5 értékű táptalajt mérünk, és 120 C°-on 30 percig autoklávban sterilizáljuk. A lombikokat ferde agaros csőről vett Candida albicans (Stíhering M 11 E) tenyészetszuszpenzióval oltjuk be, és 24 órán át rotációs rázógépen 145 ford/perc frekvenciával 30 C°-on rázatjuk. 100—100 ml ilyen inokulummal oltunk át 4 ugyanígy készített lombikot, melyekbe a beoltás, és 4 órás rázatás után 150—150 mg J5< 1( »--asztrén-17j/J-ol»3-on 1,0—ilO ml dimetiiformamidos oldatát adagoljuk. Még további 44 órán át rázatjuk .a lombikot, majd a tenyészetet kétszer 500—500 ml metilizobutilketonnal extraháljuk, és az extraktumokat vákuumban bepároljuk. A keletkezett nyerstermékből szilikagélen („PF" E. Merck AG, Darmstadt) végzett preparatív vékonyrétegfcromatográfiával izopropiléter-amilalkohol (95:5) rendszert használva, és a megfelelő zónát (Rf=0,36) metanollal eluálva Asm-ösziren-Sß, 17^-diolt izolálunk. Hexán-aceton elegyből átkristályosítva 147—149 C° olvadáspontú A^-ösztren-Zß, 17'^-diolt kapunk, 55%-os termeléssel. UV£ 102 = 6010., Az előzőkben leírtakkal teljesen megegyező körülmények között a fermentatív átalakításokat a •következő élesztőtörzsekkel végezhetjük el: 30 35 40 45 50 55 60 Candida guilliermondii (Schering M7 D) Candida krusei (NCYC 329, 332, 337,338) Candida claussenii (Schering M 11 B) Candida melilbiosi (Seihering M 7 C) Candida mycoderma (NCYC 335) Candida pelliculosa (NCYC 471) Candida pulcherrima (Schering M 11 A) Candida rugósa (NCYC 391) Candida scottii (Schering M 3 C) Candida tropicalis (NCYC 4, 5, 405, 470) Candida tropicalis Candida St. Monilia H (Institut für Gärungswerbe) Candida zeylanoides (Schering M 9 F) Debariomyces (NCYC 8) kloeckeri Pichia fermentans (NCYC 246) Rhodotorula glutinis var. gracilis Reindl 21 (Institut für Gärungswerbe) gracilis glutinis var. (NCYC 61) rubeseens gracilis graminis (NCYC 502) gracilis minuta (NCYC 62) gracilis mucilaginosa (NCYC 63) gracilis 'rubra (NCYC 142) Candida krusei (ATCC 6258) Candida stellatoidea (ATCC 11006) Candida tropicalis (ATCC 750) 2. példa: /(5(io)_ö sz trén-3;^,l 7-diol élőállítása -2 l-es Erlenmeyer lombikokba 1—1 liter, 5% glükózt, és 2% kukoricalekvárt tartalmazó, pH 65 3 literes Erlenmeyer lombikban levő 1 liter, 120 C°-on sterilizált, 5% glükózt és 2% kuko"2
