159633. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás citromsav előállítására

5 159-633 6 sze. Összerázás után a felső fázist használjuk kromatográfiás oldószerként. A citromsav R/ értéke ebben a rendszerben kb. 0,30—0,3S. A fermentációs közegből 5—10 mikroliter mintát veszünk, amelyet a fentiekben leírt módon kezelünk, majd papírra visszük át, és a kromatogram futtatását a szokásos módon végezzük. Rendszerint Whatman No. 1. minőségű papírt használunk abszorbensként, indikátorként pedig brómkrezolzöldet (amelyet úgy készítünk, hogy 0,25 g brómkrezolzöldet 400 ml acetonban oldunk, és az oldat színét zöldre állítjuk be). Minden egyes esetben standard mintaként azonosított mintából származó citromsavat használunk összehasonlításhoz. Ha a citromsav jelenlétét a közegben kromatográfiás úton kimutattuk, akkor annak jelenlevő mennyiségét ecetsavanhidrid-piridines módszerrel határozzuk meg, amelyet J. R. Marier és M. Bouler ismertet (J. Dairy. Sei., 41, 1683, 1968). Á megfelelő élesztőfajta kiválasztásánál használt fermentációs közeg utókezelése Után a szűrletet vagy a felülúszó részt 0,1 n sósavval 100 ml össztérfogatra felhígítjuk. A vizes oldat aliquot mennyiségét a fenti cikkben ismertetett módszer szerint citromsavra kvantitative meghatározzuk. A citromsavat termelő élesztőfajta azonosítása után a citromsav ipari méretű előállítását folytathatjuk le. Az ipari méretű fermentáció során előnyösnek találtuk, hogy megfelelő mennyiségű élesztősejtet állítsunk elő a fermentációs közeg beoltása előtt. Az előzőekben már rámutattunk arra, hogy az élesztősejtek kezdeti szaporítása közben a pH-érték ellenőrzése igen lényeges. Ha a közeg savassága 4 pH alatt van, akkor a sejtnöveke^ dést ez negatív irányban befolyásolja, sőt megállíthatja. Ezt a problémát úgy küszöböltük ki, hogy a közeghez kalciumkarbonátot adtunk, a kalciumkarbonát ugyanis a citromsavval reagálva már képződése közben semlegesíti a savat és a közeget az élesztősejtek növekedésének kezdeti fázisában megfelelő savassági értéken, például 4—7 pH-értékek között tartja. Kalciumkarbonáton kívül báriumkarbonát, kalciumoxid vagy báriumoxid is használható. Alternatív módon úgy is eljárhatunk, hogy a kezdeti fázisban a közeghez folyamatos módon nátriumhidroxidot, káliumhidroxidot vagy ammóniát adagolunk oldat alakjában, hogy a képződő citromsavat semlegesítsük és a savasságot pedig kb. 4 vagy afeletti értéken, előnyösen pedig 4—8 között tartsuk. A kezdeti fázis után a közeg pH ellenőrzése már nem lényeges, mivel az optimális sejtmaszsza képződése után a fermentációt 2—8 közötti pH-értékek között lefolytathatjuk. Az előnyös fermentációs eljárásokban a kezdeti sejtszaporítási fázist két külön lépésben folytatjuk le. Az első lépésben a pH-értéket nem ellenőrizzük, hanem az élesztősejteket 48 óra hosszat szobahőmérséklet közelében aerob módon szaporítjuk. A második lépésben azonban a közeg pH-értékét ellenőrizzük és a közeg túl nagy mértékű elsavasodását megelőzzük. Az első lépésben az élesztőt vizes közegben aerob módon szaporítjuk; a vizes közeg egy megfelelő szénihidrogént és asszimilálható nitrogénforrást, fontos ásványi anyagokat és növekedési faktorokat tartalmaz. Nitrogénforrásként a kereskedelmi forgalomban az NZ Amine YTT-t használjuk. A szénhidrogénből általában 5—20 súly%-ot alkalmazunk. A közeg sterile-' zése és megfelelő élesztőfajtával történő beoltása után az élesztősejteket 2 napig kb. 20 G°on szaporítjuk. Két nap eltelte után a képződő élesztő-szuszpenzió egyrészét használjuk fel a második vizes közeg beoltására, amely ammóniumsót, kukoricalekvárt, kalciumkarbonátot és kb. 5—20 súly%-ban megfelelő szénhidrogént tartalmaz. Az aerob fermentációt ezután további 48 óra hosszat folytatjuk. A második fermentációs szakasz végén az élesztő-szuszpenzió egy részét a fermentációs közeghez adagoljuk. A fermentációs közeg a szokásos asszimilálható nitrogénforrásokat, ásványi anyagokat és más növekedési faktorokat tartalmaz vizes fázisban. Fermentációs közegként például ammóniumsó, kukoricalekvár és szénhidrogén hasz^nálható. A kukoricalékvár adott esetben káliumhidrogénfoszfáttal helyettesíthető. A közeg szénhidrogén koncentrációja legalább 3 súly% legyen, abból a célból, hogy a citromsav megfelelő koncentrációját és hozamát biztosítsuk. 3 súly% alatti szénhidrogén mennyiség is használható, de gyakorlati szempontból ez nem előnyös. Kívánt esetben 50 súly%~ig terjedő szénhidrogén-koncentrációt is beállíthatunk, a találmány szerint azonban optimális eredmények elérése céljából 5—20 súly% szénhidrogén-koncentrációt javasolunk. A fermentációs közegben a víz szerepe azért jelentős* hogy a nitrogénforrások, ásványi anyagok és növekedési faktorok közegeként szolgáljon, bizonyos mennyiségű víz pedig az élesztő szaporodásának fenntartása szempontjából is szükséges. Az előbbiekben már rámutattunk arra, hogy szénhidrogénből igen magas, például 50 súly% vagy még ennél magasabb koncentráció is beállítható, gyakorlati szempontból optimális eredményt citromsav termelésénél azonban csak akkor értünk el, ha a szénhidrogén-szintet az előbbiekben megadott határok között tartjuk. A nagyipari méretű aerob szénhidrogén fermentációs folyamatoknál fontos tényező az, hogy a közeget hatékonyan levegőztessük és az élesztősejteket egyrészt az asszimilálható nitrogén és ásványi anyagokat tartalmazó vizes fázissal, másrészt a szénhidrogénnel is érintkeztessük. Mivel a szénhidrogén a vizes fázissal nem elegyedik, így fermentáció közben előnyösen a szénhidrogént finoman diszpergált alakban a vizes közegbe eloszlatjuk, így a szénhidrogénnek a vizes fázissal való érintkezésre nagy felületet biztosítunk. A vázolt módon optimális érintkezést biztosíthatunk az élesztősejtek, a vizes fázis és a szénhidrogén között. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3