159633. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás citromsav előállítására

I 150033 9 A fermentáció célszerűen süllyesztett tenyésztési módszerrel valósítható meg, amelynek során .a közeget élénk keverésben tartjuk, egyidejűleg pedig levegőt vezetünk át rajta, pl. átbuborékoltatás segítségével. A szénhidrogén megfelelő diszpergálása céljából a közeghez felületaktív szert is adhatunk. A fermentáció lefolytatására a szakirodalomban más módszerek is ismeretesek, így például tálcákon vagy más felületi technológiával dolgozunk. A fermentációt rendszerint 25—29 C° közötti hőmérsékleten 6—10 napig folytatjuk. Jóllehet a fermentáció 20—32 C" közötti hőmérsékleti határokon belül tetszés szerinti hőmérsékleten elvégezhető, mégis az előbbiekben említett előnyös hőmérsékleteket választjuk, mivel a túl alacsony fermentációs hőmérséklet a fermentációs időt meghosszabbítja, míg túl magas hőmérséklet esetén a közeg állandóan vizet veszít és így a vízmennyiség fenntartása céljából állandó ellenőrzést kell eszközölni. A találmány szerinti eljárással a szénhidrogén súlyára számítva 90% citromsav-monohidrát hozam érhető el. A citromsavat rendszerint az oldhatatlan kalciumsó alakjában izoláljuk, amely a citromsav és kalciumkarbonát reakciójának eredményeképpen képződik. Jól látható tehát, hogy a kalciumkarbonát szerepe kettős: egyrészt megakadályozza, hogy a közeg túl savassá váljon, másrészt rendkívül előnyös a fermentáció végén a citromsav kinyerésére. A fermentáció végén a képződött élesztősejteket eltávolítjuk, a kalciumcitrátot pedig szűrjük. Mind a leírásban, mind az igénypontokban a fermentációs közegből történő citromsav kinyerésén azt kell érteni, hogy a citromsavat vagy kalciumsója vagy más sója alakjában vagy szabad alakban izoláljuk. A hatékonyan asszimilálható szénforrások közül a szénhidrogéneknél a 9—19 szénaltomos nalkánokat és n-1-alkéneket találtuk alkalmasnak. A fenti csoportba tartozó szénihidrogének nem kizárólag önmagukban, hanem keverékek alakjában is alkalmazhatók. Megjegyezzük azt, hogy a vizsgált élesztőfajták a következő szénhidrogéneken citromsav termelésére nem alkalmasak: n-oktán, 1-oktén és a többi rövidszénláncú n-alkánok és 1-alkének. Továbbá a vizsgált élesztőfajták a következő szerves vegyületeken sem alkalmasak citromsav termelésére: 2,2,4,6,6-pentametilheptán, n-heptilbenzol, n-heptilciklohexán, 2,2,4,4,6,8,8-•Jheptametilnonán, n-heptadecileiklohexán, n-ejkozán, nJhexatriakontán, n-hexadecilklorid, 1--dskanol, 1-hexadekanol, n-dihexadeciléter, n-dioktiléter és naftalin. A találmány szerinti eljárás során azok az élesztő mutánsok vagy variánsok is alkalmazhatók, amelyek kémiai vagy fizikai eszközök segítségével állíthatók elő, természetesen azzal az előfeltétellel, hogy a törzsek önmagukban specifikus citromsavtermelő képességgel rendelkeznek. A variánsok előállítása röntgensugárzással vagy ibolyántúli fény besugárzással, nitrogénmustárokkal és szerves peroxidokkal, vagy egyéb ismert technológiai módszerrel történhet. Ezenkívül a szubkultúrák, természetes mutánsok, variánsok és hasonló módosulatok is alkalmasak a találmány szerinti eljárás kivitelezése során. A Candida nemhez tartozó megfelelő, citromsav előállítására alkalmas egyednek vizes szénhidrogén-tartalmú táptalajon való szaporításával a fermentációs folyamatot jelentősen meggyorsítjuk, vagyis az általunk alkalmazott fermentációs eljárás sokkal gyorsabb lefolyású, mint az eddig citromsav előállítására ismert egyéb fermentációs eljárások. Ilyen módon magától értetődően a termelési költségekben jelentős megtakarítást érünk el., Ugyanakkor a Candida nemhez tartozó citromsavat termelő egyedek lényegesen stabilabbak, mint a korábban alkalmazott citromsavat termelő organizmusok. A találmány szerinti ölj arás alkalmazásával a fermentációt színtelen táptalajon végezzük úgy, hogy a keletkező terméket magas kitermelési eredménnyel nyerjük és ugyanakkor a kitermelés során a kísérő szennyeződések aránya rendkívül alacsony. Az eddig ismert fermentációs eljárások során, így példaképpen amikor Aspergillus törzset használnak, melaszos anyagra van szükség, mellyel ragadós táptalajhoz jutnak és ebből csak igen körülményesen és nehezen történhet meg a citromsav izolálása. Nem hagyható figyelmen kívül az a körülmény sem, hogy melaszos táptalaj esetén a szennyeződések aránya igen magas és ebből az anyagból a tiszta citromsav izolálása csak igen nehezen lehetséges. A következő kiviteli példák a találmány szerrinti eljárást közelebbről szemléltetik anélkül, hogy oltalmi körét korlátoznák. 1. példa: Az élesztőfajta kiválasztása A citromsav termelőképesség szempontjából az élesztő kiválasztása szénhidrogénes táptalajon a következő módszerrel történhet: 2,0 g ammóniumszulfátot, 2,5 g kukoricalekvárt és 10,0 g kalciumkarbonátot vízhez adunk, majd az össztérfogatot 1 literre állítjuk be. Sorozatkísérletben 300 ml-es Erlenmeyer lombikokba 25—25 ml oldatot töltünk, majd a lombikokat gőzzel fűtött autoklávban 20 percig 1,4 atm. nyomáson sterilizáljuk. A lombikokhoz ezután 2—i2 ml előzetesen sterilezett n-hexadekánt adunk. A sterilezett köz-eget 7,0—<8,0 pH-értékekre állítjuk be. A vizsgálandó élesztőfajtákat burgonya-dextróz agárból és 0,3% élesztőkivonatból készített ferde tenyészeten szaporítjuk. A sterilezett fermentációs közeget a ferde agar tenyészettel be-J0 15 20 23 30 35 40 45 50 55 60 4