159633. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás citromsav előállítására

159633 asszimilálható nitrogénforrást és a szokásos ásványi faktorokat tartalmazza. A táptalajon képződött eitromsawat a szokásos eljárásokkal izoláljuk. A találmány szerinti eljárásihoz használt élesztőfajta kiválasztásánál a „The Chemistry and Biology of Yeasts" (A. H. Cook, Academic. Press, Inc., New York, 1998) és a „The Yeasts. A Taxonomic Study" című szakkönyvekben (J. Lodder és N. J. W. Kreger-van Rij, North Holland Puibl., Amsterdam, 1952) leírt klaszszifikációs rendszert alkalmaztuk. Felismerésünk szerint a Candida nemhez tartozó bizonyos egyedek azzal a képességgel rendelkeznek, hogy citromsav termelésére alkalmasak aerob fermentáció során olyan vizes közegekben, amelyek egyedüli asszimilálható szénforrásként n-alkánokat, n-4-alkéneket, vagy ezek keverékét tartalmazzák. A megfelelő élesztőtfaljták kiválasztása citromsav termelés céljára úgy .történhet, hogy' azokat olyan táptalajon szaporítjuk aerob módon, amely valamely megfelelő szénihidrogént és asszimilálható nitrogénforrást, ásványi anyagokat és növekedési faktorokat tartalmazó vizes közeg bensőséges keverékéből áll. Szénhidrogénként rendszerint n-hexadeként alkalmazunk, ezenkívül azonban más n-alkánok, sőt n-l-alkének is alkalmasak. Szénihidrogének keveréke is megfelel a kitűzött célra, feltételezhető azonban, hogy a szénhidrogénMkeveréknek bizonyos részarányban 9—19 szénatomos szénhidrogéneket kell tartalmazni. A citromsav termelő élesztőfajták kiválasztásánál általában a szénihidrogént a közegre számítva klb. 5—9 súly% koncentrációban alkalmazzuk, ez a koncentrációs határérték azomban nem döntő, vagyis ennél alacsonyabb vagy magasabb koncentráció-értékek is megfelelnek. A rendelkezésre álló szervetlen nitrogéniforrások közül a nitrogén-tartalmú sókat, mint az ammóniuimszulfátot, ammöniiumnitrátot java-. soljuk. A számos szerves nitrogénforrás közül célszerűen búzát, koripát, szójabablisztet, karlbamidot, aminosavakat vagy peptonokat alkalmazunk. A kereskedelmileg hozzáférhető peptonforrások közül az NZ, Amine YTT-t említjük, amely a Sheffield Chemical Co., Norwich, N. Y. gyártmánya. Az élesztő szaporodása szempontjából természetesen a vitaminok, mint pl. biotin, továbbá kationok és anionok, minit nátrium, kálium, kobalt, foszfát és szulfát előnyös hatást gyakorolnak. A felsorolt vitaminok és ásványi anyagok legnagyobb részben a kukoriealekvárban és néhány egyéb nitrogénforrásban, pl. a szójahabliszflben megtalálhatok, így nem okvetlenül szükséges ezeket a növekedési faktorokat külön a táptalajhoz hozzáadni. A táptalajhoz célszerűen kalciumkarbonátot is, adunk. A kalciumkarbonát a fermentáció közben képződött citromsavval reakcióba lép, ezáltal meggátolja azt, hogy a közeg pH-értéke túl savassá váljon. Ez a szemipont különösen fontos az élesztő szaporításának kezdeti fázisában, mivel azt tapasztaltuk, hogy ha a közeg túl savas, pl. a pH 4,0-nál alacsonyabb, akkor az élesztősejtek növekedése megszűnik, vagy jelentősen csökken. Feltételezhető az is, hogy i5 a kalciumkarbonát és a citromsav reakciójából képződő széndioxid az élesztősejtek metabolizmusálba beépül, és ezáltal a közegben az élesztősejtek növekedését elősegíti. Kalciuimkaríbonáton kívül báriuxnfcarbonát, sőt kalciumoxid és 10 báriumoxid is alkalmazható. A citromsav termelésére alkalmas törzs kiválasztását az alábbi módszerrel végezhetjük: Sorozatkísérletben 300 ml-es Erlenmeyer-lombikokat kb. 25 ml vizes oldattal töltjük meg, 15 amely megfelelő mennyiségiben a fent említett tápanyagokat tartalmazza a kiviteli példákban részletezett mennyiségiben. A lombikokat és azok tartalmát gőzzel fűtött autoklávban 1,4 atm. nyomáson 20 percig sterilizáljuk. Ezután 20 minden egyes palackhoz kb. 2 ml megfelelő szénhidrogént adunk, amelyet előzetesen Seitzféle szűréssel sterilezünk. Az egyes lombikokat élesztővel beoltjuk, majd azokat levegő jelenlétében kb. 7 napig szaporítjuk. A fermentációs idő természetesen a fermentációs hőmérséklettől függ, az utóbbi pedig az élesztő termelésére alkalmas hőmérsékleti határértékeken belül tetszés szerinti lehet. Az aerob fermentáció tetszés szerinti kiviteli 3Q változata felhasználható, ennek ellenére a szabályozott levegőztetésű kultúrákat részesítjük előnyben, pl. a közeget levegőatmoszférában keverjük, vagy a közegen levegőt buborékoltatunk keresztül. Az élesztő szaporítására alkal-35 mas hőmérsékleti határértékek pl. 20—37 C° között vannak, célszerűen azonban 25—29 C° közötti hőmérsékleti határértékeket alkalmazunk, a fermentációs idő pedig 5—8 nap. Miután az élesztősejteket megfelelő ideig, pl. 40 7 napig szaporítottuk, a közeget koncentrált sósavval 1,7—3. közötti pH-értékekre állítjuk be, majd az élesztősejteket centrifugálással vagy szűréssel elválasztjuk. 25 45 50 55 60 A sejtmentes közegben a citromsav jelenlétét kromatográfiás úton határozzuk meg az alábbiakban közelebbről ismertetett papírkromatográfiás rendszerben. A oldószer-rendszer: Az oldószer-rendszer 80 térfogatrész metiletilketon, 6 térfogatrész aceton, 12 rész desztillált víz és 2 rész hangyasav keveréke. Ebben a rendszerben a citromsav R/ értéke 0,59—0,64 között van. B oldószer-rendszer: Az oldószer-rendszer vízzel telített hangyasav-éter keverékből áll, amelyet úgy készítünk, hogy a komponenseket választótölcsérben öszszerázzuk. A keveréket 2100 ml etiléterből, 300 65 ml hangyasavból és 275 ml vízből állítjuk ösz-2